Журнал «Актуальная инфектология» Том 7, №5-6, 2019

Актуальність. Наприкінці ХХ століття внаслідок глобальних екологічних проблем у всьому світі спостерігається зростання кількості захворювань, викликаних патогенними та умовно–патогенними бактеріями. Особливе значення у патогенезі цих захворювань мають ендотоксини (ліпополісахариди — ЛПС). Вони відіграють важливу роль у різних взаємовідносинах «хазяїн — паразит», при вивільненні з клітин грамнегативних бактерій у кровотік, залучаються в патогенез та токсичні прояви бактеріальних інфекцій, найтяжчим серед яких є септичний шок. Відмираючі клітини збудників інфекцій та резидентної мікрофлори виділяють ЛПС у кровотік, які, взаємодіючи з СD14–рецепторами, обумовлюють низку патологічних ефектів, що мають місце при септичному шоці: утворення численних імунологічних медіаторів білкової природи — цитокінів. Якщо продукція цитокінів стає надмірною для макроорганізму, виникає запальна відповідь, що призводить до септичного шоку та смерті. Синдром сепсису є однією з основних причин смерті у відділеннях інтенсивної терапії у всьому світі, і захворюваність на нього поступово збільшується, досягаючи в деяких випадках понад 50 % рівня смертності. Статистика показує, що ендотоксичний шок посідає 13–те місце у списку найпоширеніших причин смертності. Незважаючи на те, що було проведено багато досліджень на тваринних моделях і в клінічних випробуваннях, поки не існує ефективного лікарського засобу, який безпосередньо взаємодіє з ЛПС і усуває його негативний вплив на організм. У цьому контексті пошук нових терапевтичних засобів, які можуть пригнічувати ЛПС–активацію вродженої імунної системи, має велике значення. Одним із перспективних засобів запобігання ендотоксичному шоку є застосування нетоксичного ЛПС, який здатний блокувати сайти зв’язування ендотоксично активних молекул ЛПС на поверхні клітинних мембран–мішеней, тим самим виявляючи антагоністичну дію.

Метою дослідження було виділити ЛПС із штамів Pantoea agglomerans 7460 та Esсherichia coli 2884, хімічно охарактеризувати їх, дослідити токсичність, одержати модифіковані ЛПС, перевірити їх протективні властивості.

Матеріали та методи. Виділення ЛПС із сухої бактеріальної маси проводили методом Вестфаля (45% розчином фенолу при 65–68 °С) з розділенням водного та фенольного шарів (Westphal, Jann, 1965). ЛПС очищали від нуклеїнових кислот ультрацентрифугуванням (104 000 g, 4 год). Кількісний вміст вуглеводів визначали за методом Дюбуа (Dubois M. et al., 1956); нуклеїнових кислот — методом Спіріна (Spirin A.S. et al., 1958); білка — за Лоурі (Lowry O.H. et al., 1951); 2–кето–3–дезоксіоктонової кислоти (КДО) — методом Осборна (Osborn M.J., 1970). Метилові ефіри жирних кислот та моносахариди у вигляді ацетатів поліолів аналізували на хромато–мас–спектрометричній системі Agilent 6890N/5973 inert (Варбанец Л.Д. и др., 2006). Моносахариди та жирні кислоти ідентифікували, порівнюючи час утримання ацетатів поліолів та метилових ефірів жирних кислот досліджуваних зразків зі стандартами, а також використовуючи комп’ютерну базу даних ChemStation. Модифікацію ЛПС проводили шляхом сукцинілювання. Токсичну дію ЛПС (ЛД₅₀) вивчали на здорових білих мишах при внутрішньочеревному введенні серії розведень ЛПС одразу після введення внутрішньочеревно 0,5 мл 3,2% Д–галактозамінгідрохлориду у непірогенному стерильному розчині NaCl. Кожну серію розведення препарату ЛПС випробовували на десяти мишах.

Результати дослідження та їх обговорення. ЛПС Pantoea agglomerans 7460 та Esсherichia coli 2884 були виділені та очищені від нуклеїнових кислот. Встановлено, що ЛПС містили: 41,0 та 41,6 % вуглеводів, слідові кількості білка, 2,7 та 4,96 % нуклеїнових кислот, а також 0,07 та 0,54 % КДО (специфічний компонент ЛПС грамнегативних бактерій) відповідно. Вивчення моносахаридного складу дало можливість ідентифікувати в складі ЛПС P. agglomerans 7460 такі моносахариди: Rha (40,8 %), Fuc (0,95 %), Rib (20 %), Gal (27 %), Glc (6,8 %). Водночас ЛПС E. coli 2884 містив у своєму складі Rib (4,7 %), Gal (5,3 %), Glc (41,7 %), а також були присутні Ara (2,2 %) та Man (46,1 %). Жирнокислотний аналіз ЛПС досліджуваних штамів свідчить про ідентичність складу їх ліпідів А. Єдина відмінність полягає у наявності в ліпіді А E. coli 2884 ізо–С17:0 кислоти. Крім насичених, в обох штамах була ідентифікована C14:0 (3–OH) кислота як домінуючий компонент (45,18 та 39,2 % відповідно). Тобто виділені ЛПС містили всі характерні для цих біополімерів компоненти. Дослідження токсичності показало, що ЛПС P. agglomerans 7460 (ЛД₅₀ = 74,3 мкг на 1 мишу) проявляє більшу токсичність порівняно з ЛПС E. coli 2884 (ЛД₅₀ = 150 мкг на 1 мишу). Оскільки відомо, що ендотоксичним центром молекули ЛПС є ліпід А, нами були одержані модифіковані ЛПС внаслідок сукцинілювання жирних кислот їх ліпідів А. При введенні мишам модифікованого ЛПС у дозі ЛД₅₀ загибелі експериментальних тварин не спостерігали. Тобто сукцинільований ЛПС втратив токсичні властивості. Більше того, модифікований ЛПС проявляв протективний ефект: попередньо (за 24 год) введений експериментальним тваринам, він блокував токсичну дію ендотоксично активного нативного ЛПС, оскільки загибелі тварин не спостерігалось. Відомо, що в ендотоксичній активності ЛПС суттєву роль відіграє конформація ліпіду А. Тому можна припустити, що при модифікації ЛПС мала місце зміна ендотоксично активної гексагональної конформації на неактивну ламелярну.

Висновки. Одержані модифіковані нетоксичні ЛПС P. agglomerans 7460 та E. coli 2884 здатні блокувати токсичні ефекти нативних ЛПС. Такі сполуки можна розглядати як основу потенційних захисних агентів при ендотоксичному шоці, викликаному ЛПС грамнегативних бактерій.