Журнал «Актуальная инфектология» 1 (1) 2013

Введение

Проблема вирусных гепатитов (ВГ) занимает доминирующее место среди всех заболеваний печени и является одной из наиболее актуальных в современной гепатологии. С этими инфекциями связано большинство случаев летальных исходов у больных с острыми вирусными гепатитами, а также случаи развития хронических заболеваний печени, включая цирроз и гепатоцеллюлярную карциному [1, 2]. Нельзя не принимать во внимание тот факт, что длительное течение болезни с затяжным периодом реконвалесценции и серьезными остаточными явлениями обусловливает существенный материальный ущерб, связанный с затратами на непосредственное лечение данного заболевания [2]. Такая ситуация обусловлена, с одной стороны, факторами хозяина, в частности, особенностями реагирования иммунной системы, с другой — факторами вируса, которые позволяют ему противостоять механизмам иммунитета, выживать в макроорганизме, влиять на исходы заболевания и эффективность проводимой противовирусной терапии.

За последнее время достигнуты значительные успехи в выявлении маркеров вирусных гепатитов, в раскрытии патогенетических механизмов, обеспечивающих санацию организма от гепатотропных вирусов через цитолиз собственных клеток, пораженных вирусами [3–5]. Существенным достижением современной клинической медицины является широкое использование и внедрение в лабораторную практику новых высокоинформативных диагностических технологий. Новые молекулярно–генетические и иммунологические методы диагностики, такие как индикация специфических антител к вирусам гепатитов с помощью иммуноферментного анализа (ИФА), выявление нуклеотидных последовательностей РНК и ДНК вирусов с последующим определением генотипа не только в крови, но и в различных биологических тканях, значительно расширили существующие представления об этиологии и патогенезе ВГ [6, 7]. Это позволяет на более ранних стадиях выявить инфицированных лиц, установить клиническую форму и характер течения заболевания [4]. Результаты генотипирования характеризуются большой однозначностью по сравнению с другими методами исследования и предоставляют непосредственную информацию для выявления эволюционных и эпидемиологических связей различных изолятов ВГ [6, 7].

В настоящее время молекулярно–генетические методы типирования ВГ составляют основу молекулярной эпидемиологии вирусных гепатитов, целью которой является изучение циркуляции отдельных генетических вариантов возбудителей и их причинной связи с возникновением и распространением инфекционных заболеваний.

Существующие изоляты вируса гепатита А (ГА, HAV) подразделяют на 7 генотипов, которые обозначаются римскими цифрами от I до VII [4, 5]. Генотипы вируса I, II, III и VII вызывают заболевание у человека, а генотипы IV, V, VI — у обезьян. Отличия между изолятами HAV, выделенными в разных регионах мира по нуклеотидным последовательностям геномной РНК, составляют 15–25 %, а на уровне генотипов и субтипов — 7,5 % соответственно. При этом аминокислотные последовательности изолятов HAV достаточно консервативны, что объясняет наличие всего одного серотипа у данного вируса. По данным исследователей [19], наиболее тяжелое течение заболевания отмечается у лиц с генотипом IB, IIIA, тогда как среднетяжелые формы наблюдаются при генотипе IA.

О гетерогенности популяции гепатита В (ГВ, HBV) стало известно еще в середине 70–х годов прошлого столетия, когда экспериментально серологическими методами было доказано существование субтипов поверхностного антигена вируса — HBsAg. При этом была найдена одна общая детерминанта «а», которая в комбинации с 2 дополнительными детерминантами d/y и w/r образовывала 4 субтипа HBsAg: adw, ауw, adr, ауr. Позже были описаны новые варианты детерминант, и общее количество субтипов достигло 9. На основании анализа нуклеотидных последовательностей S–гена изоляты HBV, выделенные в разных регионах мира, объединили в 8 основных генотипов, которые назвали заглавными буквами латинского алфавита: А, В, С, D, E, F, G и Н. Следует отметить, что полное соответствие между генотипами HBV и серотипами HBsAg не установлено. Так, изоляты HBV, которые относятся к четырем абсолютно разным генотипам А, В, С и F, могут иметь один и тот же серотип adw2 [5, 12, 16].

Вирус гепатита С (ГС, HCV) среди других ВГ характеризуется наибольшей генетической вариабельностью генома. Согласно классификации, все изоляты HCV группируются в 6 главных генотипах, которые обозначаются арабскими цифрами от 1 до 6. Внутри каждого генотипа выделяют субтипы, которые включают изоляты, состоящие из квазивидов. На принадлежность изолята к определенному субтипу указывают прописные латинские буквы, которые пишутся вслед за арабской цифрой: HCVla, HCVlb, HCVlc, HCV2a и т.д. В настоящее время известно более 100 субтипов HCV [14, 21].

Известные изоляты HDV сгруппированы в 3 генотипа, которые обозначаются римскими цифрами — I, II, III [14, 21].

К настоящему времени предложено выделять 5 генотипов вируса гепатита G (ГG), у которых установлена закономерность территориального распространения. Второй генотип ГG преобладает в Северной Америке, Европе, Азии и Северной Африке, первый встречается только в Западной Африке, пятый — в Южной Америке, третий и четвертый — в Юго–Восточной Азии. По данным исследователей, на территории Украины, России и стран СНГ доминирует второй генотип [6].

У верифицированного в 1997 году ДНК–содержащего вируса TTV различают 16 генотипов — G1–G16, роль которых в патологии печени изучается [1].

Таким образом, популяции ВГ насчитывают сотни генетических вариантов. В связи с этим использование рутинных лабораторных методов диагностики ВГ, основанных на определении антигенов и антител, не может дать информацию об особенностях циркуляции разных вариантов ВГ среди населения, о наличии связи между изолятами ВГ, выделенными как от отдельных пациентов, так и групп пациентов, вовлеченных во вспышки, количество которых за последние годы значительно возросло.

К сожалению, изучение генотипов облигатно–гепатотропных вирусов, циркулирующих на территории Украины, и их влияния на течение и исходы заболевания является крайне слабым звеном в работе лабораторной службы Украины.

Цель исследования: на основании генодиагностических исследований изучить клиническое течение, тяжесть и последствия вирусных гепатитов с разнообразными механизмами передачи инфекции.

Основные задания исследования:

1. Провести генотипирование HAV, HBV, HDV, HCV и выявить РНК И ДНК НGV и TTV, определить циркулирующие генотипы и их субтипы в исследуемых регионах.

2. Выявить возможные различия в клинических проявлениях заболевания в зависимости от установленных генотипов и геновариантов вирусов.

3. Установить связь с клиническими проявлениями болезни у больных ВГ.

Материалы и методы

Результаты нашей работы базируются на обследовании 141 больного ГА в различных регионах Украины; 163 больных острым ГВ (ОГВ) в Харьковском регионе, 76 больных ОГВ и 54 больных хроническим ГВ (ХГВ) в Закарпатском регионе; 155 больных HCV–инфекцией: острый ГС (ОГС) установлен у 37 больных, хронический ГС (ХГС) — у 117.

Диагноз устанавливался соответственно с учетом комплекса клинико–эпидемиологических, лабораторно–инструментальных данных обследования и подтверждался выявлением в сыворотке крови специфических серологических маркеров ВГ (анти–НАV IgM, HBsAg, анти–HBcIgM, анти–HBcIgG, HBeAg, анти–НВе, анти–НСV (сум.), анти–HCV IgM и IgG, анти–HCV core и анти–HCV NS–3, NS–4, NS–5, анти–НDV IgM) методом ИФА (ELISA) посредством тест–систем НПО «Диагностические системы» (Россия) и полимеразной цепной реакции (ПЦР) (РНК HAV, ДНК НВV и РНК HDV, PHK HCV, РНК HGV и ДНК TTV). Клинико–патогенетические варианты течения, форму и степень тяжести ВГ определяли согласно общепринятым в клинической практике критериям (МКБ–10).

Материалом для наших исследований была сыворотка крови больных в разные периоды заболевания (разгара, реконвалесценции).

Молекулярно–биологические исследования включали определение репликативной активности ВГ на основании выявления в сыворотке крови РНК и ДНК исследуемых вирусов методом ПЦР с использованием тест–систем ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ. Генотипирование вирусов проводилось с использованием рестрикционного анализа по методу М. Мizokami с соавт. (1999) в модификации ЦНИИЭ г. Москвы.

Полученные результаты исследований статистически обработаны с использованием методов вариационной статистики, что осуществлялось посредством программ Exсel–2002 и Statistiсa for Windows (Statsoft Inc., США) на компьютере с процессором CPU Athlon 64–3200 Tray.

Результаты и их обсуждение

Выявление и обследование больных ГА, как отмечалось, проводилось в различных регионах Украины. Среди обследованных больных (n = 141) у 16 % была выявлена микст–инфекция (HAV и HBV — у 9,6 % и HAV и HCV — у 6,4 %).

При генотипировании вируса ГА в 75 % случаев (105 больных) был выявлен генотип 1А вируса ГА, у 36 пациентов — генотип 3А, что составило 25 % (рис. 1).

Удельный вес разных генотипов ГА у больных в разных регионах Украины представлен на рис. 2.

Следует отметить, что в Закарпатской, Полтавской и Николаевской областях среди спорадических случаев ГА был выявлен только доминирующий генотип 1А.

Важно отметить, что при изучении тяжести течения ГА в зависимости от выявленного генотипа нами было установлено, что у лиц с генотипом 3А отмечается более тяжелое течение болезни по сравнению с таковым у больных с генотипом 1А (рис. 3).

Таким образом, генотипирование вируса ГА у больных с разным течением заболевания позволило вы–явить два генотипа: 1А и 3А. Генотип 1А является доминирующим среди спорадических случаев заболевания ГА, поскольку его частота составляет 75 %, а генотип 3А встречался значительно реже — у 25 % больных.

Клинически у пациентов с установленным генотипом 1А НАV заболевание протекало циклически с различной степенью тяжести, однако превалировали легкие формы (61 и 39 %), тогда как у больных с генотипом 3А регистрировался больший процент среднетяжелых форм болезни (42 и 58 % соответственно).

При генотипировании вируса ГВ у 84,5 % больных (n = 208) был установлен генотип D вируса ГВ, у 17 пациентов — генотип А, что составило 8,4 %. Количество больных, у которых была выявлена ДНК НВV, но генотип вируса установить не удалось, — 14 чел. (7,1 %) (рис. 4).

По результатам генодиагностических исследований с определением генотипов вируса ГВ у пациентов с ОГВ установлено значительное преобладание как в Харьковском, так и в Закарпатском регионах генотипа D (90,8 и 71,1 %) и редкая встречаемость генотипа А (2,5 и 19,7 % соответственно).

Следует отметить, что частота выявления генотипа А HBV в Закарпатском регионе значительно превышала таковую среди пациентов с острой НВV–инфекцией в Харьковском регионе — 19,7 и 2,5 % соответственно, что свидетельствует об особенности территориального распространения генотипов НВV в Украине.

При обследовании больных ХГВ была зарегистрирована почти одинаковая частота как генотипа А, так и генотипа D HBV — 41,8 и 39,2 % соответственно. Некоторые специалисты считают, что генотип А вируса ГВ имеет более низкую антигенность по сравнению с генотипом D и вследствие этого — более низкую способность чем генотип D, индуцировать иммунный ответ, поэтому данный генотип ассоциируется с большим риском развития хронического гепатита.

Для выявления возможной взаимосвязи между клиническими проявлениями болезни и генотипом НВV нами проводилось сравнение частоты отдельных клинических симптомов в зависимости от установленного генотипа вируса (табл. 1).

Данные табл. 1 показывают, что у пациентов с генотипом А чаще встречалась тяжесть в эпигастрии — в 80 %, тогда как у лиц с генотипом D — в 46,3 % случаев (р < 0,05). Кожный зуд — в 46,7 и 18,5 % случаев соответственно (р < 0,05). Также значительно чаще у больных с генотипом А по сравнению с генотипом D отмечались: тошнота — в 93,3 % случаев (р > 0,05), артралгии — в 20 % случаев (р > 0,05), повышение температуры тела — в 33 % случаев (р > 0,05), однако указанные значения не отличались статистической достоверностью.

Анализируя данные некоторых биохимических показателей у пациентов с ОГВ в зависимости от выявленного генотипа, было установлено, что для лиц с генотипом А НВV свойственно более выраженное повышение активности трансаминаз (аланинаминотрансфераза (АлАТ) в остром периоде повышалась до 7,5 ± 0,4 ммоль/л · ч, в то время как у больных с генотипом D — до 5,3 ± 0,2 ммоль/л · ч; р < 0,05) (табл. 2). Уровень общего белка в группе больных с генотипом А имел тенденцию к снижению (60,9 ± 3,2 г/л) по сравнению с соответствующим показателем у больных с генотипом D (69,5 ± 2,9 г/л) (р < 0,05).

При сравнении частоты клинических проявлений ХГВ в зависимости от установленного генотипа HBV у лиц, которые находились под нашим наблюдением, также были выявлены некоторые различия (табл. 3).

Проявления диспептического синдрома чаще встречались у лиц с генотипом А HBV по сравнению с таковыми у пациентов с генотипом D: снижение аппетита (96,8 % против 69,7 %), тошнота (54,8 % против 18,2 %), тяжесть в правом подреберье (93,5 % против 54,5 % случаев) (р < 0,05).

У больных с генотипом А HBV также значительно чаще отмечались боли при пальпации в правом подреберье, при этом средние показатели отличались статистической достоверностью (р < 0,05). Это коррелировало с жалобами этих больных на тяжесть в правом подреберье (р > 0,05). Кроме того, у больных ХГВ с генотипом А HBV желтуха проявлялась в 2,5 раза чаще, чем у пациентов с генотипом D, — 22,6 % против 9,1 % (р < 0,05). У всех пациентов с ХГВ с установленными генотипами А и D HBV отмечались общая слабость и гепатомегалия.

Изучая биохимические показатели сыворотки крови у больных ХГВ в зависимости от установленных генотипов HBV, было выявлено (табл. 4), что показатели активности АлАТ превышали у лиц с генотипом А (5,6 ± 0,8 ммоль/л · ч) таковые при генотипе D, которые в среднем составляли 3,7 ± 0,4 ммоль/л · ч (р < 0,05).

У пациентов с генотипом А уровень общего билирубина превышал таковой у пациентов с генотипом D — 85,9 ± 10,5 мкмоль/л и 58,4 ± 9,2 мкмоль/л (р < 0,05) соответственно.

Диспротеинемия при воспалительно–некротических процессах печеночной ткани также была несколько выше в группе больных с генотипом А. Так, концентрация гамма–глобулина у больных с данным генотипом составляла 31,4 ± 2,6 г/л, а с генотипом D — 28,2 ± 1,8 г/л (р > 0,05). Полученные результаты биохимических исследований поражения печени свидетельствуют о более высокой активности инфекционного процесса у больных ХГВ с генотипом А в отличие от пациентов с генотипом D.

Изучение особенностей клинических проявлений острой и хронической HBV–инфекции в зависимости от установленного генотипа показало, что у больных, инфицированных генотипом D HBV, наблюдалось более мягкое течение как острого, так и хронического ГВ с менее выраженной клинической симптоматикой, с умеренным проявлением мезенхимально–воспалительного и цитолитического синдромов и умеренными биохимическими изменениями в сыворотке крови больных. И наоборот, у пациентов с генотипом А НВV отмечается более выраженное течение болезни с пре–обладанием диспептических проявлений, с большей активностью некробиотических и воспалительных процессов в печени. Все это подчеркивает более высокую вирулентность и иммуногенность генотипа А НВV, с более частым развитием хронизации процесса у этой группы больных.

Для изучения генотипов HDV нами было обследовано 155 больных с HBV–инфекцией: 76 больных — с ОГВ и 79 — с ХГВ. Среди обследованных у 18 больных (11,6 %) была выявлена РНК HDV, из них 7 мужчин (38,8 %) и 11 женщин (61,2 %) (рис. 5).

Анализ полученных результатов показал, что среди пациентов с ОГВ РНК HDV была выявлена у 7 больных, что составило 9,2 %, тогда как среди пациентов с ХГВ РНК HDV верифицирована в 13,9 % (11 пациентов). При этом был установлен І генотип вируса, субтип а. Согласно данным исследователей, именно этот генотип обусловливает легкие формы инфекции с высокой частотой хронизации процесса, тогда как генотип ІІ отличается менее патогенными свойствами. Генотип III связывают с развитием фульминантных форм HDV–инфекции.

Для определения циркулирующих генотипов HCV было обследовано 155 больных HCV–инфекцией, среди них ОГС установлен в 23,9 % случаев, ХГС — в 76,1 % случаев. Частота выявления отдельных генотипов HCV представлена на рис. 6.

Анализируя результаты молекулярно–генетических исследований, установили, что РНК НСV определялась в крови всех больных ОГС и у 77,89 % больных ХГС. Генотип HCV 1b оказался наиболее распространенным среди больных как ОГС (50 %), так и ХГС (43,3 %). Второе место занял генотип 3а, который регистрировался у 30 и 38,3 % больных ОГС и ХГС соответственно. У больных ОГС с одинаковой частотой встречались комбинация 1b/3а и 2 генотипов HCV — у 10 % больных соответственно. Комбинация генотипов 1а/3а и изолированный моногенотип 1а среди больных ОГС не определялся. В то же время у больных ХГС комбинация генотипов 1b/3а — у 6,7 %. С одинаковой частотой (5,0 %) регистрировались комбинации генотипов 1а/3а и 3а моногенотип. Частота регистрации 2 генотипа была наиболее редкой — всего у 1,7 % больных ХГС.

Состояние иммунной регуляции у больных НСV–инфекцией, как известно, зависит от репликативной активности вируса, его генотипа, цитолитической активности ГС. В результате проведенных иммунологических исследований установлено, что у больных ОГС и ХГС с генотипом 3а HCV наблюдается превалирование клеточного звена иммунитета, тогда как при генотипе 1b — гуморального.

В крови больных ХГС по мере роста степени биохимической активности отмечается статистически достоверное снижение уровней клеточных иммунных показателей наряду с одновременным повышением показателей гуморального звена иммунитета.

На предмет инфицирования HGV– и ТТV–вирусами в Украине нами были обследованы больные острыми и хроническими формами HBV–инфекции.

При обследовании 76 больных ОГВ в 14,47 % (11 пациентов) методом ПЦР была выявлена РНК HGV. В то время как из 79 больных ХГВ данный вирус был выявлен только в 5 % случаев (4 больных) (рис. 7).

Проведенный анализ на наличие ДНК ТТV методом ПЦР позволил выявить среди больных острой НВV–инфекцией вирус TTV в 72,8 % (51 больной) (рис.  8).

Следует отметить, что при сравнении отдельных данных клинических проявлений болезни и биохимических изменений, а также длительности стационарного лечения достоверных отличий между ТТV–позитивными и ТТV–негативными группами больных ОГВ выявлено не было, что требует более детального изучения этого явления на большем количестве пациентов.

Выводы

1. Генетические особенности вирусов гепатитов могут определять течение и исходы инфекционного процесса.

2. Генотипические особенности вирусов могут являться маркерами прогноза эффективности противовирусной терапии и стойкости вирусов к используемым препаратам.

3. Для более полного понимания патогенеза заболевания необходимо изучение генетических особенностей возбудителя на разных уровнях гетерогенности.