Газета «Новости медицины и фармации» Антимикробная и противовирусная терапия (236) 2008 (тематический номер)

З метою реалізації основних положень «Глобальної стратегії ВООЗ з стримування стійкості до антимікробних препаратів», зниження поширеності резистентних до антибіотиків мікроорганізмів, особливо в лікувально-профілактичних закладах; зниження захворюваності і летальності від інфекційних захворювань, викликаних резистентними штамами, забезпечення ефективної антимікробної терапії, удосконалення методів визначення резистентності мікроорганізмів до антимікробних засобів, що застосовуються в закладах охорони здоров'я країни, та гармонізації їх з міжнародними вимогами

НАКАЗУЮ:

1. Затвердити методичні вказівки «Визначення чутливості мікроорганізмів до антибактеріальних препаратів» (далі — методичні вказівки), що додаються.

2. Міністру охорони здоров'я Автономної Республіки Крим, начальникам управлінь охорони здоров'я обласних, Головного управління охорони здоров'я та медичного забезпечення Київської та управління охорони здоров'я Севастопольської міських державних адміністрацій, Головному державному санітарному лікарю Автономної Республіки Крим, головним державним санітарним лікарям областей, міст Києва та Севастополя, на залізничному, повітряному та водному транспорті.

2.1. Забезпечити використання в підпорядкованих закладах охорони здоров'я стандартизованих методів визначення антибіотикорезистентності, проведення систематичного аналізу поширення штамів, резистентних до дії антибіотиків, етіологічної структури інфекцій і рівнів резистентності збудників у лікувально-профілактичних закладах різного профілю згідно з затвердженими методичними вказівками.

2.2. Вжити заходи щодо забезпечення лабораторій мікробіологічного профілю необхідними діагностичними препаратами для ідентифікації мікроорганізмів, визначення їх антибіотикорезистентності, тест-штамами для внутрішньолабораторного контролю якості досліджень, впровадження системи мікробіологічного моніторингу за антибіотикорезистентністю за допомогою комп'ютерної програми WHO-5, рекомендованої ВООЗ.

2.3. Провести в 1-му кварталі 2007 року семінари з медичними працівниками з питань контролю за антибіотикорезистентістю і методів її визначення.

2.4. Забезпечити направлення штамів резистентних мікроорганізмів до Центральної санепідстанції МОЗ України для подальшого вивчення.

2.5. Інформацію про виконання цього наказу надавати до Центральної санепідстанції МОЗ України щороку до 01 березня.

3. Головному лікарю Центральної санепідстанції МОЗ України, Головному державному санітарному лікарю Автономної Республіки Крим, головним державним санітарним лікарям областей, міст Києва та Севастополя, на залізничному, повітряному та водному транспорті забезпечити систематичне, не рідше 2 разів на рік, проведення зовнішнього контролю якості досліджень з визначення антибіотикорезистентності в лікувально-профілактичних установах та закладах державної санепідслужби шляхом надання контрольних задач.

4. Головному лікарю Центральної санепідстанції МОЗ України Некрасовій Л.С., Директору науково-дослідного інституту епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського АМН України Марієвському В.Ф. (за згодою) забезпечити вивчення штамів резистентних мікроорганізмів, що циркулюють в Україні, із застосуванням методів молекулярної біології з метою аналізу механізмів резистентності і створення колекції.

5. Визнати такими, що не застосовуються на території України:

5.1. Приказ МЗ СССР от 13.03.75 № 250 «Об унификации методов определения чувствительности микроорганизмов к химиотерапевтическим препаратам».

5.2. «Методические указания по определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом диффузии в агар с использованием дисков», затверджені МОЗ СРСР 10.03.83 № 2675-83.

6. Контроль за виконанням цього наказу покласти на Директора Департаменту організації медичної допомоги населенню Моісеєнко P.O. та Директора Департаменту державного санітарно-епідеміологічного нагляду МОЗ України Пономаренка A.M.

Перший заступник Міністра, Головний державний санітарний лікар України С.П. Бережнов

ЗАТВЕРДЖЕНО

Наказ МОЗ України № 167 від 05.04.2007 р.

МЕТОДИЧНІ ВКАЗІВКИ «ВИЗНАЧЕННЯ ЧУТЛИВОСТІ МІКРООРГАНІЗМІВ ДО АНТИБАКТЕРІАЛЬНИХ ПРЕПАРАТІВ»

1. Загальні положення

Методичні вказівки «Визначення чутливості мікроорганізмів до антибактеріальних препаратів» (далі — методичні вказівки) підготовлені відповідно до Постанови Головного державного санітарного лікаря України від 27.05.98 № 11 «Про порядок розробки, побудови, викладення, оформлення, затвердження державних санітарних правил і норм, гігієнічних нормативів та методичних документів» і встановлюють стандартні методи визначення чутливості мікроорганізмів до антибактеріальних препаратів.

Методичні вказівки призначені для застосування в мікробіологічних лабораторіях установ охорони здоров'я.

В останні роки в усьому світі відмічається різке зростання стійкості мікроорганізмів до антибактеріальних препаратів (далі — АБП), що негативно впливає на контроль над багатьма важливими хворобами.

Резистентність збудників інфекцій до АБП веде до збільшення термінів лікування хворих, підвищує летальність і збільшує тривалість епідемій. В економічному плані ріст антибіотикорезистентності у бактерій призводить до суттєвого підвищення вартості терапії. Проблема антибіотикорезистентності мікроорганізмів визнана глобальною, і в даний час однією із стратегічних задач у всьому світі є стримування розвитку і розповсюдження антибіотикорезистентних мікроорганізмів. Тому проведення лабораторних досліджень з метою визначення чутливості мікроорганізмів — збудників інфекційних хвороб людини до АБП набуває все більш важливого значення.

Стандартні методи визначення чутливості мікроорганізмів до АБП (диско-дифузійний та серійних розведень) були розроблені у другій половині XX століття і з тих пір принципово не змінилися. Проте впровадження у клінічну практику значної кількості нових АБП і поява нових механізмів антибіотикорезистентності у мікроорганізмів вимагають більш суворої стандартизації процедури тестування, розробки нових підходів до інтерпретації результатів, впровадження сучасної системи внутрішнього контролю якості на кожному етапі дослідження.

Вивчення чутливості мікроорганізмів до АБП здійснюються для вирішення низки завдань:

— обгрунтування цілеспрямованої індивідуальної антибактеріальної терапії для лікування конкретної інфекційної хвороби;

— обгрунтування емпіричної терапії окремих нозологічних форм інфекційних хвороб в межах лікувальних установ або регіонів;

— спостереження за розповсюдженням антибіотикорезистентності в окремих установах або регіонах;

— дослідження нових хімічних сполук на наявність антибактеріальної активності.

Класифікація антибактеріальних препаратів. З урахуванням механізму дії антибіотики поділяють на три основні групи:

— інгібітори синтезу клітинної стінки мікроорганізму (пеніциліни, цефалоспорини, ванкоміцин, тейкопланін та ін.);

— антибіотики, що порушують молекулярну організацію, функції клітинних мембран (поліміксин, ністатин, леворин, амфотерицин та ін.);

— антибіотики, що пригнічують синтез білка і нуклеїнових кислот, зокрема, інгібітори синтезу білка на рівні рибосом (хлорамфенікол, тетрациклін, макроліди, лінкоміцин, аміноглікозиди) і інгібітори РНК-полімерази (рифампіцин) та ін.

На наш погляд, найзручнішою для користування є класифікація за хімічною будовою.

2. Показання для дослідження чутливості мікроорганізмів до антибактеріальних препаратів

Дослідженню на чутливість до АБП підлягають чисті культури мікроорганізмів або ізольовані колонії із щільних поживних середовищ (далі — ПС) первинного посіву клінічного матеріалу. Визначення чутливості з використанням клінічного матеріалу (без виділення чистої культури) можливе тільки у виняткових випадках за умови підтвердження однорідності культури і високого ступеня обсіменіння при мікроскопії мазків, забарвлених за Грамом. При такій ситуації дослідження слід повторити після виділення чистої культури мікроорганізму.

При виявленні на щільних ПС первинного посіву змішаної культури, досліджувати антибіотикочутливість до ідентифікації і оцінки етіологічної значимості окремих мікроорганізмів недоцільно.

Разом з тим визначення чутливості виділених мікроорганізмів до АБП виправдане далеко не в усіх випадках, виявлення показань для такого дослідження є обов'язком лікаря-бактеріолога. Слід пам'ятати, що:

— визначати чутливість до АБП представників нормальної мікрофлори людини з природних місць знаходження, бактерій, виділених з об'єктів довкілля, за винятком випадків проведення досліджень для епідеміологічного типування, недоцільно;

— підтвердження природної чутливості або резистентності мікроорганізму до АБП не є завданням практичних лабораторій;

— не слід в рутинних дослідженнях вивчати мікроорганізми, для яких в даний час не стандартизовані методи визначення чутливості і відсутні критерії інтерпретації результатів. Такі результати не можуть бути підставою для призначення антибактеріального препарату;

— проводити визначення чутливості до препаратів у мікроорганізмів, що проявляють універсальну чутливість до них, тобто коли випадків резистентності не описано (наприклад, усі штами Streptococcus pyogenes, N.meningitidis чутливі до пеніциліну), недоцільно.

3. Методи визначення чутливості мікроорганізмів до антибактеріальних препаратів

Серед стандартизованих методів визначення чутливості мікроорганізмів до АБП розрізняють методи серійних розведень та дифузійні. Крім того, в даний час все більш широкого розповсюдження набувають автоматичні методи.

Методи серійних розведень базуються на прямому визначенні мінімальної інгібуючої (подавляючої) концентрації (далі — МІК) препарату, що характеризує мікробіологічну активність АБП.

МІК — мінімальна концентрація препарату, яка пригнічує видимий ріст досліджуваного мікроорганізму в бульйонній культурі або на щільному поживному середовищі.

Для визначення величини МІК певні концентрації АБП вносять у поживне середовище, яке потім засівають культурою досліджуваного мікроорганізму і після інкубації оцінюють наявність або відсутність видимого росту.

Розрізняють методи серійних розведень в агарі або в бульйоні. В залежності від об'єму використаного бульйону розрізняють методи серійних макро- і мікророзведень. В автоматизованих системах для визначення чутливості мікроорганізмів використовується метод, заснований на використанні тільки двох концентрацій АБП, які відповідають граничним значенням МІК.

В основу дифузійних методів визначення чутливості покладена дифузія АБП із носія у щільне ПС до концентрації препарату, яка перевищує МІК і пригнічує ріст досліджуваної культури в цій зоні. Існують дві основні модифікації дифузійного методу: диско-дифузійний та Е-тест.

В диско-дифузійному методі у якості носія АБП використовують паперовий диск. Утворення зони пригнічення росту відбувається в результаті дифузії АБП з носія в ПС. Диско-дифузійний метод дозволяє лише опосередковано зробити висновок про величину МІК, а результатом дослідження є віднесення мікроорганізму до однієї з категорій чутливості (чутливий, помірно стійкий або резистентний).

Е-тест — це вузька полімерна смужка (0,5 ´ 6,0 см), на яку нанесений градієнт концентрацій АБП (від мінімальних до максимальних). Пригнічення росту мікроорганізму навкруги смужки Е-тесту відбувається тільки в тій зоні, де концентрація АБП, що дифундує з носія, вище МІК, при цьому утворюється краплеподібна зона інгібіції. Значення концентрацій АБП на кожній ділянці носія нанесені на зовнішній (зверненій до дослідника) поверхні Е-тесту. Величину МІК вираховують в тому місці, де межа зони пригнічення росту впритул підходить до носія. Детальні інструкції про визначення чутливості з використанням Е-тестів додаються виробником до набору.

3.1. Основні етапи проведення тестування. Для вивчення антибіотикочутливості мікроорганізму незалежно від методу дослідження необхідно послідовно виконати такі етапи:

— приготувати поживні середовища;

— приготувати суспензії досліджуваних мікроорганізмів (інокулюма);

— внести інокулюм в поживне середовище;

— інкубувати посіви визначений проміжок часу при відповідних температурних параметрах;

— облік результатів та їх інтерпретація, формулювання рекомендацій щодо лікування.

Дифузійні методи включають також етап накладання дисків або смужок Е-тесту на щільне ПС.

3.1.1. Приготування поживних середовищ для визначення чутливості.

Для оцінки чутливості використовують спеціально призначені для цього ПС, дозволені до застосування в Україні в установленому порядку. Вид ПС для оцінки чутливості залежить від обраного методу проведення дослідження (агар або бульйон), а також мікроорганізму, що підлягає тестуванню.

Міжнародно визнаними поживними середовищами для визначення чутливості мікроорганізмів до антибіотиків є агар або бульйон Мюллер — Хінтона і середовища, приготовані на їх основі. Доведено, що середовище АГВ непридатне для визначення чутливості до багатьох сучасних антимікробних препаратів. ПС, що застосовуються, за своїми характеристиками повинні задовольняти вимогам, наведеним в розділі 4.2.

Обране ПС для визначення чутливості готують із сухого середовища промислового виробництва відповідно до інструкції виробника. Після автоклавування ПС розливають в стерильні пробірки або чашки Петрі. При необхідності колби з ПС поміщають на водяну баню при 48–50 °С, де витримують до досягнення вказаної температури, після чого в них асептично вносять термолабільні поживні добавки та/або робочі розчини антибіотиків, а потім розливають в пробірки або в чашки Петрі. Товщина агару у чашках повинна бути 4 мм, а тому на чашку діаметром 100 мм потрібно 25 см³ агару, на чашку діаметром 90 мм — 20 см³. Чашки залишають при кімнатній температурі для застигання. Приготовані таким чином чашки Петрі бажано використовувати негайно. Допускається зберігання їх в запаяних поліетиленових пакетах в холодильнику при 4–8 °С не більше 5 діб.

3.1.2. Приготування мікробної суспензії (інокулюма). Приготування мікробної суспензії досліджуваного мікроорганізму певної густини є загальною і принципово важливою вимогою для усіх методів тестування, її концентрація повинна становити 1,5 ´ 10⁸ колонієутворюючих одиниць (далі — КУО)/см³, що при візуальному контролі відповідає стандарту мутності 0,5 за Мак-Фарландом. Контроль оптичної густини суспензії може також здійснюватися денситометрично, наприклад за допомогою денситометра. Бактерійну суспензію можна готувати з бульйонної або з агарової культури.

Приготування інокулюма з агарової культури. Для приготування інокулюма відбирають 3–5 однотипних, чітко ізольованих колоній, що виросли на неселективних щільних ПС після 16–24 годин інкубації. Петлею переносять незначну кількість матеріалу з верхівок колоній в пробірку із стерильним фізіологічним розчином або поживним бульйоном, доводячи густину інокулюма точно до 0,5 за стандартом Мак-Фарланда. При наявності накопиченої біомаси чистої культури беруть повну петлю зливного росту і аналогічним чином суспендують в 4–5 см³ стерильного фізіологічного розчину/поживного бульйону. Інокулюм слід використовувати не пізніше 15 хв після приготування.

Не можна використовувати як інокулят нерозведені бульйонні культури або нестандартизований інокулюм!

Приготування інокулюма з бульйонної культури. При визначенні чутливості бактерій із звичайними поживними потребами, які швидко ростуть, для приготування інокулюма можна використовувати 5–6-годинну бульйонну культуру мікроорганізму. Для цього відбирають декілька однотипних ізольованих колоній, петлею переносять незначну кількість матеріалу в пробірку з 4,0–5,0 см³ рідкого неселективного ПС. Інкубують при 35 °С. Через 5–6 год інкубації густина мікробної суспензії приблизно відповідає необхідній, і її точно доводять до 0,5 за Мак-Фарландом, додаючи стерильний бульйон або фізіологічний розчин.

3.1.3. Приготування стандарту 0,5 за Мак-Фарландом. Стандарт Мак-Фарланда може бути придбаний або приготований в лабораторії.

До 0,5 см³ розчину ВаСl₂ в концентрації 0,048 моль/дм³ (1,175% розчин ВаС1₂ ´ 2Н₂О) повільно при ретельному перемішуванні додати 99,5 см³ розчину Н₂SО₄ в концентрації 0,18 моль/дм³ (1%) до отримання гомогенної суспензії.

Тестування стандарту мутності проводять за допомогою фотометра. Поглинання при використанні кювети 1 см повинно становити 0,08–0,10 при довжині хвилі 625 нм.

Отриману суспензію розливають по 4–6 см³ в пробірки з кришками, що герметично закриваються. Пробірки повинні бути такого ж діаметра, як і для приготування бактерійного інокулюма. Зберігають пробірки з суспензією в темному місці при кімнатній температурі не більше 6 міс.

Перед використанням пробірки ретельно струшують і оцінюють однорідність суспензії. При появі видимих частинок пробірки не використовують. Стандарт мутності поновлюють або перевіряють його оптичну густину щомісячно.

3.2. Методи серійних розведень.

3.2.1. Приготування розчинів АБП для методів серійних розведень. Надзвичайно важливим етапом для всіх методів серійних розведень є приготування розчинів АБП. Розрізняють основні розчини АБП (придатні для зберігання) і робочі, які необхідно використовувати ex tempore для приготування ПС.

Основні розчини препарату готують із субстанції АБП з відомою активністю, лікарські форми для цього не придатні. Для зважування субстанцій використовують електронні лабораторні терези з точністю до 4-го знака, для вимірювання об'ємів — калібровані дозатори і піпетки.

Основні розчини АБП готують в концентрації 1000,0 мкг/см³ і вище. Враховуючи активність АБП, готують його наважку для базового розчину. Розрахунок наважок АБП для приготування базового розчину роблять за формулою:

де mАБ теор. — розрахункова (теоретична) наважка АБП; С — необхідна концентрація АБП; V теор. — об'єм розчинника для розчинення теоретичної наважки; А — активність АБП (кількість активної речовини, що міститься в субстанції).

Зважити точно розрахункову кількість порошку практично неможливо, тому готують близьку до розрахункової наважку, а потім перераховують кількість необхідного розчинника.

де V практ. — об'єм розчинника для розчинення практичної наважки;

mАБ практ. — отримана наважка АБП;

mАБ теор. — розрахункова (теоретична) наважка АБП;

V теор. — об'єм розчинника для розчинення теоретичної наважки.

АБП істотно розрізняються за розчинністю, тому виникає необхідність використовувати різні речовини для первинного розчинення препаратів (розчинники) і для доведення їх до заданої концентрації (разбавлювачі). У випадках, коли розчинники і розбавлювачі є різними речовинами, для розчинення АБП необхідно використовувати мінімальну кількість розчинника.

Основні розчини зберігають при температурі не вище –20 °С, але терміни зберігання окремих АБП при цій температурі істотно відрізняються. Оптимальними умовами для зберігання основних розчинів АБП є температура –60 °С і нижче, тривалість — не більше 6 міс. Основні розчини бета-лактамних АБП можуть втрачати активність і в більш ранні терміни.

Діставши флакони з готовими основними розчинами із холодильника, необхідно довести їх до кімнатної температури для запобігання конденсації вологи. Повторне заморожування основних розчинів не допускається.

З робочих розчинів готують двократні розведення АБП. При розрахунках за основу беруть кінцеву концентрацію АБП в ПС, яка дорівнює 1,0 мкг/см³ (більш високі — 2, 4, 8 і т.ін.; більш низькі — 0,5; 0,25; 0,125 і т.ін.). При цьому реальні концентрації розчинів повинні враховувати фактор розбавлення розчину АБП при приготуванні чашок з щільним ПС або при інокуляції. Діапазон двократних серійних розведень АБП залежить від виду мікроорганізму, що підлягає тестуванню, активності АБП і мети дослідження.

3.2.2. Метод серійних розведень в бульйоні. Метод серійних розведень в бульйоні використовують у двох основних варіантах: макрометод (пробірочний) і мікрометод (кінцевий об'єм 0,2 см³ і менше). Макрометод може використовуватись для оцінки чутливості одиничних штамів, оскільки має низьку продуктивність.

Макрометод. Тестування проводиться в об'ємі 1 см³ кожного розведення АБП з кінцевою концентрацією досліджуваного мікроорганізму приблизно 5 ´ 10⁵ КУО/см³. Поживний бульйон розливають по 0,5 см³ в кожну пробірку. Кількість пробірок визначається необхідним діапазоном розведень АБП і збільшується на одну для постановки «негативного контролю».

Робочий розчин АБП готують з основного розчину з використанням рідкого ПС. Концентрацію робочого розчину розраховують, виходячи з необхідної максимальної концентрації у ряді серійних розведень, враховуючи, що при подальшій інокуляції препарат буде ще розбавлений. Робочий розчин в кількості 0,5 см³ за допомогою мікропіпетки із стерильним наконечником вносять в першу пробірку, що містить 0,5 см³ бульйону. Ретельно перемішують і новим стерильним наконечником переносять 0,5 см³ розчину АБП в бульйоні в наступну пробірку з 0,5 см³ бульйону. Цю процедуру повторюють, поки не буде приготований весь необхідний ряд розведень. З останньої пробірки 0,5 см³ бульйону видаляють.

Отже, отримують ряд пробірок з розчинами АБП, концентрації яких відрізняються в сусідніх пробірках в 2 рази. Одночасно готують додаткові ряди серійних розведень АБП для тестування контрольних штамів. Серія розведень обов'язково повинна включати граничні концентрації і допустимі діапазони МІК для контрольних штамів.

Для інокуляції використовують мікробну суспензію, еквівалентну 0,5 за стандартом Мак-Фарланда, розведену в 100 разів на поживному бульйоні, після чого концентрація мікроорганізму в ній становитиме приблизно 10 6 КУО/см³. По 0,5 см³ інокулюма вносять в кожну пробірку, що містить по 0,5 см³ відповідних розведень АБП, і в одну пробірку з 0,5 см³ поживного бульйону без антибіотика як «негативний контроль». Кінцева концентрація мікроорганізму в кожній пробірці досягне необхідної — приблизно 5 ´ 10⁵ КУО/см³. Інокулюм повинен бути внесений в пробірки з розведеннями АБП не пізніше 15 хв з моменту його приготування.

Пробірки закривають стерильними пробками, і всі, крім пробірки з «негативним контролем», інкубують в звичайній атмосфері при температурі 35 °С протягом 16–20 або 20–24 год (в залежності від виду досліджуваного мікроорганізму). Пробірка з «негативним контролем» поміщається в холодильник при 4 °С до обліку результатів.

Для визначення наявності росту мікроорганізму пробірки з посівами переглядають у проходячому світлі. Ріст культури у присутності АБП порівнюється з «негативним контролем», що містить початковий інокулюм, який зберігався у холодильнику. МІК визначається за найменшою концентрацією АБП, яка пригнічує видимий ріст мікроорганізму.

Мікрометод. Тестування проводиться в об'ємі 0,2 см³ і менше, що дозволяє значно скоротити кількість витратних матеріалів. Його перевагами є висока продуктивність і можливість тривалого зберігання заздалегідь приготованих планшетів. Методика не має технічних відмінностей від макрометоду, але вимагає оснащення лабораторії багатоканальними піпетками, стерильними 96-лунковими планшетами з кришками для імунологічних досліджень (з плоским дном). Після внесення робочих розчинів антибіотиків в лунки запаяні в поліетилен планшети можуть зберігатися при темп ературі –60 °С і нижче до моменту використання. Повторне заморожування — відтавання не допускається.

Перед проведенням дослід ження планшети витримують до досягнення ними кімнатної температури, після чого їх інокулюють приготованою суспензією досліджуваного мікроорганізму. Під час інкубації для запобігання висихання вмісту лунок планшет обов'язково повинен бути закритий кришкою.

Облік результатів проводять візуально або спектрофотометрично, порівнюючи ріст мікроорганізму у присутності АБП із ростом культури у лунці без АБП. За МІК приймають мінімальну концентрацію, що забезпечує повне пригнічення видимого росту досліджуваного штаму.

При використанні комерційних тест-систем для дослідження антибіотикорезистентності методом серійних мікророзведень, дозволених до застосування в Україні в установленому порядку, слід користуватися інструкціями виробників.

При постановці методів серійних розведень в бульйоні необхідно проводити контроль росту культури в середовищі без АБП, чистоти суспензії мікроорганізму (шляхом висіву на неселективні середовища). Кожне тестування штамів супроводжується внутрішнім контролем якості дослідження з використанням відповідних контрольних (референтних) штамів.

3.2.3. Метод серійних розведень в агарі. Метод серійних розведень в агарі дозволяє одночасно визначити МІК партії штамів (до 30 клінічних штамів). Для дослідження висівають штами мікроорганізму на чашки Петрі з агаром, що містить послідовні подвійні розведення антибіотика. Паралельно тестують відповідні контрольні штами, а також контролюють ріст мікроорганізмів на чашках без АБП і чистоту культури.

Для приготування серійних розведень АБП з основного розчину досліджуваного препарату готують робочий розчин в концентрації, яка в 10 разів перевищує використану максимальну для конкретного дослідження. Потім готують серію двократних розведень робочого розчину. Для приготування серії розведень використовуються стерильні хімічно інертні лабораторні ємності з кришками об'ємом не менше 10 см³ (для зручності розмішування).

Поживне середовище готують відповідно до інструкції виробника. Після автоклавування колби з ПС поміщають на водяну баню при 48–50 °С, де витримують до досягнення вказаної температури, після чого в них асептично вносять 1 частину робочого розчину АБП на 9 частин розплавленого агару і, при необхідності, термолабільні поживні добавки. Середовище ретельно перемішують і розливають у чашки Петрі.

Можна готувати чашки Петрі з агаром, що містить розведення АБП, змішуючи ПС і розчин препарату безпосередньо в чашці Петрі. Для цього чашки заздалегідь маркують, вказавши препарат і його концентрацію. У стандартні пластикові чашки діаметром 90 мм вносять 2 см³ розчину АБП і додають 18 см³ нагрітого до 50 °С рідкого агару. Ретельно перемішують агар плавними різноспрямованими круговими рухами чашки. Після приготування чашок агар повинен затвердіти в горизонтальному положенні. Не можна різко пересувати, переносити чашки до повного застигання агару. Паралельно з чашками Петрі, що містять розчини антибіотиків, для контролю росту готують чашки Петрі без антибіотиків. Чашки залишають при кімнатній температурі для застигання і підсушування на 10–12 год.

Приготовані таким чином чашки Петрі слід використовувати негайно, проте допускається зберігання в запаяних поліетиленових пакетах при 4–8 °С до 5 діб (крім чашок, що містять бета-лактамні антибіотики).

Стандартну мікробну суспензію, яка відповідає стандарту 0,5 за Мак-Фарландом розводять у 10 разів. Отриману суспензію необхідно інокулювати на поверхню агару протягом 15 хв з моменту приготування, при цьому утворюється пляма діаметром 5–8 мм. Для контролю якості приготування суспензій періодично проводять підрахунок реальних КУО шляхом висіву зразка приготованого інокулюма на неселективні поживні середовища.

Після інокуляції чашки залишають при кімнатній температурі для підсихання, перевертають їх і інкубують при температурі 35 °С протягом 18–24 год (в залежності від виду досліджуваного мікроорганізму).

Облік результатів проводять, помістивши чашку на темну поверхню, що не відбиває світло. Концентрація, що викликала повну інгібіцію видимого росту, є МІК. Для диференціювання ніжного росту від нальоту, що залишився після інокулята, доцільно використовувати стереомікроскоп. Наявність однієї колонії на чашці з концентрацією на 1 розведення вище, ніж явна МІК, можна не враховувати.

При постановці методів серійних розведень в агарі обов'язково проводять контроль росту культури на чашці Петрі з поживним середовищем, яке не містить АБП і чистоти культури. Кожне тестування штамів супроводжується внутрішнім контролем якості дослідження з використанням відповідних контрольних (референсних) штамів.

Методи серійних розведень є найточнішими і найінформативнішими, проте їх постановка в практичних лабораторіях пов'язана зі значними методичним труднощами: необхідність використання субстанцій антибіотиків з відомим рівнем активності, суворого дотримання режимів зберігання, ретельного виконання контролю якості поживних середовищ, трудомісткості приготування робочих розчинів антибіотиків.

Використання тест-систем на основі методу мікророзведень дозволяє уникати трудомістких процедур стандартизації підготовчих етапів і при цьому забезпечує отримання достовірних кількісних результатів щодо рівня антибітикорезистентності.

3.3. Диско-дифузійний метод (далі — ДДМ). Метод оснований на здатності АБП дифундувати з просочених ними паперових дисків в поживне середовище і пригнічувати ріст мікроорганізмів, посіяних на поверхні агару.

Для визначення чутливості ДДМ використовують поживні середовища такі ж, як і для методу розведень в агарі, а тому використовуються і ті ж методи контролю їх якості. Щільне поживне середовище готують відповідно до інструкції виробника, розливають у чашки Петрі шаром товщиною 4,0 ± 0,5 мм, попередньо виставивши їх на горизонтальну поверхню (вивірену рівнем, без западин і опуклостей). Це вкрай важливо, оскільки розмір і форма зони пригнічення росту залежать від глибини і рівномірності агарового шару. Чашки залишають при кімнатній температурі для застигання. Зберігати чашки можна запаяними в поліетиленові пакети при 4–8 °С протягом 5 діб. Перед інокуляцією чашки підсушують у термостаті при 35 °С з привідкритою кришкою протягом 10–20 хв. Конденсату рідини на внутрішній поверхні кришок не повинно бути.

Диски з антибіотиками. Для визначення чутливості ДДМ використовують тільки стандартизовані якісні диски. Виготовлення дисків з АБП для визначення чутливості диско-дифузійним методом в лабораторних умовах не допускається.

Достовірність результатів дослідження залежить також від умов зберігання готових комерційних дисків, оскільки вміст в них антибіотиків може знизитися нижче допустимого рівня до закінчення терміну придатності. Зберігати диски з АБП тривалий термін слід в герметичній упаковці в морозильній камері при температурі –18 °С і нижче. Невеликі партії дисків, що використовуються в повсякденній роботі, можна тримати в холодильнику при температурі 4–8 °С, щільно закупореними, щоб гарантувати неможливість попадання у флакон вологи, крім того, для додаткового захисту від вологи флакони (картриджі) з дисками комерційного виготовлення містять спеціальний вологопоглинач (силікагель). Флакони (картриджі) з дисками слід витримувати перед використанням герметично закритими до досягнення ними кімнатної температури протягом 1 години, що запобігає утворенню конденсату на дисках після відкривання флаконів.

Приготування бактерійної суспензії і інокуляція. При визначенні чутливості ДДМ використовують стандартний інокулюм, що відповідає 0,5 за стандартом Мак-Фарланда, тобто містить приблизно 1,5 ´ 10⁸ КУО/см³. Інокулюм спід використовувати протягом 15 хвилин з моменту приготування. Для інокуляції чашок з агаром можна використовувати два способи.

1. Стерильний ватний тампон (комерційного виготовлення) занурюють у підготовлену суспензію мікроорганізму, надлишок інокулюма відтискають об стінки пробірки. Інокуляцію проводять штриховими рухами у трьох напрямах, повертаючи чашку Петрі на 60°.

2. Стандартний інокулюм наносять піпеткою на поверхню чашки Петрі з поживним середовищем в об'ємі 1–2 см³, рівномірно розподіляють по поверхні похитуванням, надлишок інокулюма видаляють піпеткою. Привідкриті чашки підсушують при кімнатній температурі протягом 10–15 хв.

На поверхню ПС наносять диски з АБП. Аплікацію дисків проводять за допомогою стерильного пінцета або автоматичного диспенсора. Відстань від диска до краю чашки і між дисками повинна бути 15–20 мм, тобто на одну чашку діаметром 100 мм слід поміщати не більше 6 дисків з АБП. Диски повинні рівномірно контактувати з поверхнею агару, для чого їх слід акуратно притиснути пінцетом.

Відразу після аплікації дисків чашки Петрі поміщають в термостат догори дном і інкубують при температурі 35 °С протягом 18–24 год (в залежності від виду досліджуваного мікроорганізму). Збільшення інтервалу часу між нанесенням дисків на поверхню середовища і початком інкубації, а отже і початком росту досліджуваної культури, приводить до «переддифузії АБП» в агар і до збільшення діаметра зони пригнічення росту.

Облік результатів. Після інкубації чашки поміщають догори дном на темну матову поверхню так, щоб світло падало на них під кутом 45° (облік у відбитому світлі). Діаметр зон затримки росту виміряють з точністю до 1 мм (бажано користуватися штангенциркулем або кронциркулем).

При вимірюванні зон затримки росту орієнтуються на зону повного пригнічення видимого росту. Не спід звертати увагу на дуже дрібні колонії, які виявляються в межах зони затримки росту тільки за особливих умов освітлення або збільшення, і ледь помітний наліт біля краю зони. Винятком є результати визначення чутливості стафілококів до оксациліну, коли необхідно враховувати і найдрібніші колонії, виявлені в межах чіткої зони пригнічення росту.

Крупні колонії в межах чіткої зони пригнічення росту свідчать про наявність сторонньої мікрофлори або про гетерорезистентність популяції мікроорганізмів, в цьому випадку необхідно повторити ідентифікацію мікроорганізму, що формує цю колонію, і визначення чутливості цього штаму.

При визначенні чутливості ДДМ штамів протеїв, що рояться, зона пригнічення росту може бути затягнутою тонкою вуалеподібною плівкою, яка не заважає встановленню межі зони і не враховується при реєстрації результатів.

При визначенні чутливості до сульфаніламідів і їх комбінації з триметопримом межу зони пригнічення росту враховують на рівні пригнічення росту на 80 %. Це пов'язано з тим, що під дією цих препаратів перед повним пригніченням росту можливо завершення 1–2 циклів проліферації мікроорганізму.

Для ідентифікації і тестування чутливості мікроорганізмів до антибіотиків можна використовувати мікробіологічні аналізатори, зареєстровані і дозволені до використання в Україні.

Вибір між диско-дифузійним і автоматичним методами можна зробити у відповідності до таких критеріїв, як кількість антибіотикограм, які треба здійснити; види бактерій, що підлягають тестуванню; затрачений час та вартість. Обидва методи мають порівнювані результати при правильному використанні. Кожен із зазначених методів має свої сильні та слабкі сторони, які подані в таблиці, що наводиться нижче:

4. Контроль якості визначення чутливості

При визначенні чутливості мікроорганізмів до АБП будь-яким методом необхідно виконувати процедури внутрішнього контролю якості дослідження.

Вірогідність результатів дослідження чутливості мікроорганізмів до АБП залежить від складу ПС, відповідності реальної активності антибіотиків паспортній характеристиці (активності), дотримання стандартності виконання всіх лабораторних процедур.

Контроль якості визначення чутливості з використанням набору контрольних штамів слід проводити щоразу паралельно з тестуванням клінічних ізолятів. Проте при отриманні досить стабільних результатів контролю якості протягом хоча б одного місяця, частота контрольних досліджень може бути скорочена до 1–2 разів на тиждень. Контрольні дослідження проводять при використанні нових партій реагентів, перш за все ПС. Якщо при проведенні подібного тестування одержані результати виявляться за межами вказаних норм, необхідно повернутися до щоденного контролю якості для з'ясування причини отримання неправильних результатів.

4.1. Контроль чистоти росту культури. Інокулюм, використаний для оцінки чутливості, засівають на чашку з неселективним ПС та інкубують протягом 16–24 годин. При виявленні на неселективному середовищі змішаної культури результати оцінки антібіотикочутливості не враховують, дослідження повторюють.

4.2. Контроль якості поживних середовищ. Кожна партія щільних ПС для визначення чутливості повинна перевірятися на придатність для росту досліджуваних мікроорганізмів. Для цього використовують відповідні контрольні штами: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae.

Для приготування мікробної суспензії густиною 0,5 за стандартом Мак-Фарланда (містить приблизно 1,5 ´ 10⁸ КУО/см³) використовують добові культури вказаних мікроорганізмів, з яких готують серію послідовних розведень 1 : 10. Потім на приготовані чашки з відповідним ПС висівають по 0,1 см³ суспензії 10–5, 10–6, 10–7 розведень, що містять відповідно 1 ´ 10³, 1 ´ 10², 1 ´ 10¹ КУО/см³. При хороших поживних властивостях середовища повинен виявлятися ріст мікроорганізмів з 10–6, 10–7 розведень.

Для контролю росту при визначенні чутливості методами розведень (в агарі, в рідкому ПС) використовують чашки з агаром, пробірки з бульйоном, або спеціально виділені лунки мікротитрувального планшета, в які не внесений АБП.

Для контролю стерильності проводять інкубацію при 35 °С протягом 24 або більше годин репрезентативної кількості чашок з агаром з кожної партії при визначенні чутливості ДДМ; чашок з агаром або пробірок з бульйоном, які не містять антибіотиків, при тестуванні методом розведень в агарі або макророзведень в бульйоні відповідно. При визначенні чутливості методом мікророзведень контроль стерильності проводиться у спеціально виділених для цієї мети лунках мікротитрувального планшета, в які не вносять розчини антибіотиків і мікробну суспензію.

Прийнятний діапазон рН для ПС при визначенні чутливості 7,2–7,4. Якщо показник виходить за вказані межі, можливі істотні відхилення результатів визначення чутливості від належних значень. Якщо результати тестування контрольних штамів знаходяться у визначених межах, допустимо не контролювати рН приготованого ПС. При виникненні проблем з результатами тестування контрольних штамів, особливо до АБП, активність яких може істотно змінюватися під впливом рН ПС (аміноглікозиди, макроліди, тетрациклін та ін.), необхідно провести визначення рН середовища після автоклавування, внесення всіх необхідних добавок і охолодження до кімнатної температури (25 °С). Для вірогідного визначення рН використовують рН-метр з поверхнево-активним електродом, інші методи визначення рН (за допомогою лакмусового паперу, звичайного рН-метра) не повинні використовуватися, оскільки не забезпечують отримання точних результатів.

Контроль катіонного складу. Для отримання відтворюваних результатів визначення чутливості до АБП (особливо до аміноглікозидів, фторхінолонів, карбапенемів, тетрацикліну та деяких інших) ПС повинне містити суворо стандартизовані концентрації двовалентних катіонів, перш за все Са²⁺ і Мg²⁺ (Са²⁺ = 20–25 мг/дм³ і Мg²⁺ = 10–12,5 мг/дм³). Про вміст їх у середовищі опосередковано можна зробити висновок за результатами тестування чутливості контрольного штаму Pseudomonas aeruginosa до аміноглікозидів — діаметр зони навкруги диска з гентаміцином повинен бути в межах 16–21 мм, a МІК гентаміцину — в межах 0,5–2,0 мкг/см³.

При визначенні чутливості до АБП із групи антагоністів фолієвої кислоти (антифолатів) — сульфаніламідів і триметоприму — вкрай важливим показником є вміст антагоністів дії цих препаратів — тиміну та тимідину в поживному середовищі. ПС для визначення чутливості до сульфаніламідів і триметоприму повинні містити мінімальні концентрації тимідину. Про придатність ПС для визначення чутливості до антифолатів можна зробити висновок за результатами тестування контрольного штаму Enterococcus faecalis. Середовище вважається задовільним за якістю щодо тиміну та тимідину при МІК триметоприму/сульфаметоксазолу щодо Е.faecalis < 0,5/9,5 мг/дм³ і діаметрі зони пригнічення росту навкруги диска з цим АБП > 20 мм.

Результати контролю ПС реєструють в Журналі виготовлення та контролю поживних середовищ (ф. 256/0, затверджена наказом МОЗ України від 04.01.01 № 1), вказуючи назву середовища, номер серії, назву та номер тест-штаму, розведення культури, число колоній, що виросло на твердих поживних середовищах або число пробірок, у яких виявлено ріст при дослідженні рідких поживних середовищ.

Тестування контрольних штамів проводять відповідно до описаних вище методів паралельно з дослідженням клінічних ізолятів. Результати визначення чутливості (МІК або діаметрів зон пригнічення росту) контрольних (референтних) штамів мікроорганізмів зіставляють з відповідними показниками їх паспортної характеристики. Якщо вони відповідають паспортним характеристикам цих штамів, то умови постановки експерименту відповідали стандартним. Результати визначення чутливості клінічних ізолятів, отримані в цих умовах, спід визнати достовірними. Результати контролю реєструють в Журналі реєстрації досліджень і результатів визначення чутливості мікроорганізмів до хіміотерапевтичних препаратів (ф. 254/0, затверджена наказом МОЗ України від 04.01.01 № 1)

4.3. Контрольні штами, їх використання і зберігання. Як контрольні використовують штами, які відрізняються генетичною стабільністю і добре вивченими фенотипічними характеристиками, включаючи рівень чутливості до АБП. Міжнародно визнаними є штами із Американської колекції типових культур мікроорганізмів АТСС (American Type Cultures Collection). Вибір референтних штамів для проведення контрольних досліджень визначається видом досліджуваного мікроорганізму:

Enterobacteriaceae — E.coli АТСС 25922, Е.соlі АТСС 35218;

Pseudomonas spp., Acinetobacter spp. і інші НФБ — P.aeruginosa АТСС 27853;

Staphylococcus spp. — S.aureus ATCC 29213 — для методів серійних розведень і АТСС 25923 — для диско-дифузійного;

Enterococcus spp. — Е.faecalis ATCC 29212 — для методу серійних розведень і скринінгу на високий рівень резистентності до аміноглікозидів;

Streptococcus spp. — S.pneumoniae ATCC 49619;

Haemophilus spp. — H.influenzae ATCC 49247, H.influenzae ATCC 49766;

Neisseria gonorrhoeae — N.gonorrhoeae ATCC 49226.

В умовах лабораторії штами повинні зберігатися так, щоб можливість мутацій і контамінації культури була мінімальною. Контрольні штами, призначені для тривалого зберігання, зберігаються в музеї (колекції) лабораторії, а для щоденної рутинної роботи використовують регулярно субкультивовані культури.

Для тривалого зберігання штамів існують два основні способи. Перший полягає в приготуванні суспензії мікроорганізмів в стабілізуючому розчині (16 % гліцериновому бульйоні з кров'ю або без) і зберігання у замороженому стані при температурі –20 °С і нижче в морозильній камері або в рідкому азоті. Інший метод тривалого зберігання контрольних штамів — у ліофілізованому вигляді.

Для нетривалого зберігання «робочих контрольних штамів» їх вирощують в пробірці зі скошеним агаром (триптиказо-соєвим або іншим аналогічним для «невибагливих мікроорганізмів», шоколадним, кров'яним або сироватковим для «вибагливих бактерій») і зберігають в холодильнику при температурі 2–8 °С, субкультивуючи щотижня.

Якщо «робочі контрольні штами» виявилися контаміновані або результати визначення чутливості контрольного штаму не вкладаються в необхідні межі і методика визначення чутливості не порушувалась, «робочий штам» повинен бути замінений на свіжий з музею (колекції). Перед використанням для контролю якості визначення чутливості його двічі субкультивують на відповідних ПС.

5. Визначення чутливості окремих груп бактерій до АБП і інтерпретація результатів

5.1. Принципи вибору АБП для тестування різних видів мікроорганізмів та інтерпретації результатів. Для вибору АБП і включення його в дослідження необхідно знати про природну чутливість певних видів мікроорганізмів або їх груп, про розповсюдження серед них набутої резистентності, про клінічну ефективність АБП. Доцільно обирати АБП, які мають щодо виділених мікроорганізмів природну активність, клінічно підтверджену ефективність при відповідних інфекціях, препарати, що використовуються у клінічній практиці певної лікувальної установи залежно від контингенту пацієнтів, особливостей етіологічної структури інфекцій і поширеності набутої антибіотикорезистентності.

АБП, чутливість до яких рекомендується визначати у різних видів мікроорганізмів, прийнято поділяти на дві групи: підлягаючі вивченню в першу чергу (І група) і додаткові (II група). Оцінка чутливості до препаратів І групи дозволяє отримати мінімально необхідну інформацію для обгрунтовування раціональної терапії інфекції, викликаної досліджуваним мікроорганізмом.

Для виявлення маркерів того або іншого механізму стійкості визначають детермінанти резистентності за допомогою оцінки чутливості до АБП. Наприклад, використання оксациліну як маркера стійкості Staphylococcus spp. до всіх бета-лактамних антибіотиків, пов'язаної з наявністю mесА гена.

При складанні наборів АБП для вивчення чутливості враховують закономірності перехресної резистентності бактерій до різних представників однієї групи АБП. В межах деяких груп АБП можна виділити підгрупи препаратів, щодо яких бактерії проявляють повну перехресну резистентність. У цих випадках достатньо оцінити чутливість тільки до одного АБП даної підгрупи.

Набір АБП для визначення чутливості різних видів мікроорганізмів в конкретних закладах може бути скоректований фахівцями цього закладу.

Інтерпретація результатів оцінки чутливості полягає в прогнозуванні результату антибактеріальної терапії на основі даних дослідження збудника інфекції in vitro відповідно до належності досліджуваного мікроорганізму до однієї з трьох категорій:

— чутливий — штам пригнічується при концентраціях АБП, що створюються в органах і тканинах людини при рекомендованих лікувальних дозах. Лікування інфекції, викликаної мікроорганізмом, що належить до цієї категорії, як правило, ефективне при застосуванні АБП в рекомендованих дозах;

— помірно стійкий — МІК АБП для штамів цієї категорії вище, ніж для чутливих, але знаходиться в межах, досяжних при рекомендованих режимах дозування. Лікування інфекції, викликаної мікроорганізмом, що належить до цієї категорії, може бути ефективним при застосуванні АБП у підвищених дозах, або при локалізації осередку інфекції в тих органах або тканинах, де через фізіологічні особливості створюються підвищені концентрації препарату;

— стійкий — штам не пригнічується при концентраціях АБП, що створюються в органах і тканинах при рекомендованих режимах дозування. Ці штами мають певні механізми резистентності. Лікування інфекції, викликаної мікроорганізмом, що належить до цієї категорії, буде неефективним.

5.2. Визначення чутливості представників родини Enterobacteriaceae. Представники родини Enterobacteriaceae є одними з провідних етіологічних агентів інфекцій, для яких характерна велика різноманітність можливих механізмів резистентності до АБП.

При дослідженні мікроорганізмів родини Enterobacteriaceae слід використовувати окремі набори АБП для визначення чутливості збудників:

— некишкових інфекцій (крім інфекцій сечовивідних шляхів) — табл. 13;

— кишкових інфекцій (Shigella spp., Salmonella spp., Escherichia spp.) — табл. 14;

— позалікарняних інфекцій сечовивідних шляхів (ІСШ) — табл. 15.

Необхідність такого розподілу пов'язана з особливостями фармакокінетики окремих АБП в шлунково-кишковому тракті і сечовивідних шляхах, а також відмінностями в їх клінічній ефективності.

Критерії інтерпретації результатів визначення чутливості для штамів Enterobacteriaceae (граничні значення МІК АБП і відповідні діаметри зон пригнічення росту) наведені в табл. 2.

Оцінка антибіотикочутливості Enterobacteriaceae — збудників некишкових інфекцій. В основі лікування некишкових інфекцій, викликаних представниками родини Enterobacteriaceae, лежать бета-лактамні антибіотики. Практично повністю втратили значення при лікуванні некишкових інфекцій, викликаних мікроорганізмами родини Enterobacteriaceae, такі препарати, як незахищені аміно-, карбокси- і уреїдопеніциліни, а також цефалоспорини І покоління, а тому оцінка чутливості до них не має практичного значення. Альтернативою бета-лактамам є аміноглікозиди і фторхінолони.

Оцінювати чутливість збудників некишкових інфекцій до тетрацикліну, хлорамфеніколу і ко-тримоксазолу недоцільно, оскільки ці препарати є бактеріостатиками і істотно поступаються за ефективністю антибіотикам інших груп, крім того, до них значно поширена резистентність.

Характеристика препаратів першого ряду. Ампіцилін. Є типовим представником підгрупи амінопеніцилінів. Отримані результати можна повністю екстраполювати на амоксицилін (оцінювати чутливість до амоксициліну недоцільно, оскільки критерії чутливості до цього антибіотика для Enterobacteriaceae не обгрунтовані). Включення ампіциліну в набір для тестування Enterobacteriaceae важливо для оцінки фенотипу досліджуваного мікроорганізму та внутрішнього контролю якості.

Інгібіторозахищені амінопеніциліни амоксицилін/клавуланат і ампіцилін/сульбактам схожі за своїми антибактеріальними властивостями. Разом з тим необхідно мати на увазі, що клавуланат є ефективнішим інгібітором бета-лактамаз.

Цефотаксим або цефтріаксон. Обидва цефалоспорини ідентичні за своїми антибактеріальними властивостями. Результати визначення чутливості до вказаних антибіотиків необхідно оцінювати, враховуючи можливу продукцію мікроорганізмами бета-лактамаз розширеного спектра (далі — БЛРС). При підтвердженні продукції БЛРС всі цефалоспорини незалежно від конкретних результатів тестування слід розглядати як клінічно недостатньо ефективні.

Цефтазидим не рекомендується для лікування інфекцій, викликаних Enterobacteriaceae, але він як високочутливий препарат до дії більшості БЛРС може служити маркером продукції цих ферментів досліджуваним мікроорганізмом.

Гентаміцин. Результати, одержані при оцінці чутливості до гентаміцину, не можна екстраполювати на інші аміноглікозиди.

Фторхінолони не мають істотних відмінностей в рівні антибактеріальної активності щодо Enterobacteriaceae. Між цими препаратами (ципрофлоксацин, офлоксацин, пефлоксацин, нові «антипневмококові фторхінолони») спостерігають практично повну перехресну резистентність.

Характеристика додаткових препаратів. Включення в набір для дослідження додаткових антибіотиків визначається особливістю лікувально-профілактичного закладу. У важких випадках доцільно включати у дослідження наступні антибіотики.

Карбапенеми. Стійкість до цих антибіотиків серед Enterobacteriaceae зустрічається дуже рідко і, як правило, носить перехресний характер між окремими представниками групи, тому в дослідження достатньо включити лише один препарат.

Цефепім має значно більшу стійкість до хромосомних бета-лактамаз класу С порівняно з цефалоспоринами III покоління, може також зберігати активність щодо частини продуцентів БЛРС.

Цефоперазон/сульбактам, тикарцилін/клавуланат. Препарати можуть зберігати активність in vitro відносно частини продуцентів БЛРС, але підтвердження про наявність або відсутність клінічної ефективності вказаних АБП при інфекціях, викликаних продуцентами БЛРС, відсутні.

Цефокситин — не має реального значення в лікуванні інфекцій, викликаних Enterobacteriaceae, проте може бути використаний для диференціації продуцентів БЛРС і АmрС: продуценти БЛРС — чутливі, продуценти АmрС — стійкі.

Амікацин. До амікацину зберігає чутливість значна частина штамів, стійких до гентаміцину. Оцінювати чутливість Enterobacteriaceae до інших аміноглікозидів недоцільно.

Для оцінки чутливості збудників інфекцій легкого і середнього ступенів тяжкості в дослідження слід включати цефалоспорини II покоління і оральні цефалоспорини ІІ–ІІІ поколінь.

При визначенні чутливості мікроорганізмів родини Enterobacteriaceae особливо важливим є виявлення штамів, що продукують бета-лактамази розширеного спектру. Для детекції БЛРС необхідне послідовне проведення скринінгу (виявлення підозрілих штамів) і підтверджуючих тестів відносно підозрілих штамів. Для ефективного скринінгу в рутинне мікробіологічне дослідження необхідно включати декілька цефалоспоринових антибіотиків, мінімальний набір повинен включати три цефалоспорини ПІ покоління — цефотаксим, цефтриаксон і цефтазидим.

Методи скринінгу БЛРС і підтверджуючі тести викладені нижче.

У разі виявлення або підозри на продукцію БЛРС необхідно інформувати клініцистів про високу вірогідність клінічної неефективності терапії пеніцилінами і цефалоспоринами І–IV поколінь незалежно від конкретних результатів визначення чутливості.

При монотерапії цефалоспоринами III покоління генералізованих інфекцій, викликаних мікроорганізмами груп Enterobacter, Citrobacter, Serratia, Morganella, Providencia можливий розвиток резистентності в процесі лікування.

Інтерпретація результатів оцінки резистентності до хінолонів не викликає труднощів. Штами, стійкі до нефторованих хінолонів, можуть зберігати чутливість до фторованих. А тому можна вважати, що між ципрофлоксацином, офлоксацином, пефлоксацином, ломефлоксацином і сучасними антипневмококовими фторхінолонами (левофлоксацин, спарфлоксацин і моксифлоксацин) є повна перехресна резистентність.

Тестування Enterobacteriaceae  — збудників кишкових інфекцій. Основними збудниками кишкових інфекцій є представники родів Shigella, Salmonella, Escherichia і Yersinia, що належать до родини Enterobacteriaceae, а також родин Spirillaceae (рід Campylobacter) і Vibrionaceae. При кишкових інфекціях визначення чутливості слід проводити тільки для штамів родини Enterobacteriaceae.

Перелік АБП, які підлягають дослідженню, обмежений і включає препарати з підтвердженою клінічною ефективністю. При генералізованих інфекціях, викликаних мікроорганізмами роду Salmonella (виділення збудника із стерильних локусів), в дослідження необхідно включати цефалоспорини III покоління (цефотаксим або цефтріаксон).

Додатково можна включити хлорамфенікол і тетрациклін, проте їх роль в лікуванні інфекцій шлунково-кишкового тракту на сьогодні є вкрай сумнівною. Разом з тим результати визначення чутливості до цих препаратів можуть мати певне значення для епідеміологічного моніторингу.

Тестування Enterobacteriaceae — збудників позалікарняних інфекцій сечовивідних шляхів. Формування окремого набору антибактеріальних препаратів для оцінки чутливості збудників позалікарняних ІСШ доцільно при наявності значного потоку таких досліджень. Для тестування штамів Enterobacteriaceae, виділених при нозокоміальних ІСШ використовують той же перелік АБП, що і для визначення чутливості збудників інфекцій різної локалізації.

Виявлення БЛРС у штамів Enterobacteriaceae фенотиповими методами. Продукція БЛРС може бути практично у всіх видів родини Enterobacteriaceae. Враховуючи поширеність ферментів цієї групи, доцільно проводити скринінг усіх виділених в лабораторії штамів Enterobacteriaceae з подальшим використанням спеціальних підтверджуючих досліджень штамів, які за даними попереднього тестування проявляють знижену чутливість хоча б до одного з цефалоспоринів III покоління (МІК > 2 мг/л або еквівалентне зменшення діаметра зони пригнічення росту — табл. 3). Для проведення скринінгу не потрібно проводити спеціальні дослідження, досить включити у перелік АБП декілька цефалоспоринових антибіотиків, навіть якщо використання їх як терапевтичних препаратів не планується. В основі скринінгу лежить аналіз даних, отриманих у рутинній практиці.

Найчутливішими до гідролізу БЛРС є цефподоксим і цефтазидим, а тому саме ці препарати доцільно включати в набір для визначення чутливості Enterobacteriaceae. При неможливості тестування цефподоксима мінімальний набір цефалоспоринів IV покоління, що використовуються для визначення чутливості грамнегативних мікроорганізмів, повинен включати цефотаксим, цефтриаксон і цефтазидим.

Чим більше цефалоспоринів використано для тестування, тим більш достовірними будуть результати виявлення БЛРС.

При виявленні штаму, підозрілого на продукцію БЛРС, рекомендується провести підтверджуючий тест. Всі фенотипічні тести для підтвердження продукції БЛРС є варіантами стандартних методів визначення чутливості до АБП, основаними на інгібіції БЛРС клавуланатом. При постановці цих тестів проводиться порівняння чутливості досліджуваних мікроорганізмів до різних цефалоспоринів III покоління і до комбінації цих антибіотиків з клавулановою кислотою.

У диско-дифузійному методі використовують стандартні диски із звичайним вмістом цефотаксиму і цефтазидиму (30 мкг) або диск з цефподоксимом (10 мкг), а також диски, що містять комбінації: цефотаксим + клавуланат, цефтазидим + клавуланат (30/10 мкг) або цефподоксим + клавуланат (10/10 мкг). В дослідження доцільно включати одночасно і диски з цефотаксимом, і диски з цефтазидимом і їх комбінаціями з клавуланатом. Методика постановки тесту стандартна. Відмінність в діаметрах зон пригнічення росту для дисків з цефподоксимом/клавулановою кислотою і цефподоксимом на 6 мм і більше, для дисків з цефотаксимом/клавулановою кислотою і цефотаксимом, цефтазидимом/ клавулановою кислотою і цефтазидимом — на 5 мм і більше свідчить про продукцію штамом БЛРС. Результат є позитивним, якщо вказані відмінності отримані хоча б для однієї пари дисків. Для контролю якості дослідження використовують 2 штами (негативний і позитивний контроль):

— негативний контроль: при тестуванні контрольного штаму Е.соli, не продукуючого бета-лактамази, відмінності в діаметрах зон між дисками з інгібітором і без нього не повинні перевищувати 2,0 мм;

— позитивний контроль: при тестуванні контрольного штаму K.pneumoniae, продукуючого БЛРС, відмінності в діаметрах зон між дисками з цефподоксимом/клавулановою кислотою і цефподоксимом > 6 мм, з цефотаксимом/клавулановою кислотою і цефотаксимом > 3 мм, з цефтазидимом/клавулановою кислотою і цефтазидимом > 5 мм.

При використанні методу серійних розведень в бульйоні роблять подвійні серійні розведення препаратів в наступних діапазонах концентрацій:

цефтазидиму — від 0,25 до 128,0 мг/дм³,

цефтазидиму/клавуланату — від 0,25/4,0 до 128,0/4,0 мг/дм³;

цефотаксиму від 0,25 до 64,0 мг/ дм³;

цефотаксиму/клавуланату — від 0,25/4,0 до 64,0/4,0 мг/дм³.

В дослідження доцільно включати обидва цефалоспорини і їх комбінації з клавулановою кислотою. Методика виконання дослідження стандартна. Зниження МІК цефтазидиму або цефотаксиму не менше, ніж у 8 разів (на 3 послідовні двократні розведення) у присутності інгібітора порівняно із значеннями МІК відповідних цефалоспоринів без інгібіторів свідчить про продукцію штамом БЛРС. Для контролю якості дослідження використовують 2 штами:

— негативний контроль: при тестуванні контрольного штаму Е.соli, не продукуючого бета-лактамази, співвідношення МІК відповідних цефалоспоринів III покоління до МІК їх комбінації з клавуланатом має бути < 8;

— позитивний контроль: для штаму K.pneumoniae, продукуючого БЛРС, співвідношення значень МІК цефалоспоринів і МІК їх комбінацій з клавуланатом має бути > 8.

У якості підтверджуючого тесту може бути використаний і метод «подвійних дисків», в якому використовуються комерційні диски з цефалоспоринами III покоління і з амоксициліном/клавуланатом. Цей метод дозволяє виявити продукцію БЛРС за наявністю розширеної зони пригнічення росту навколо диска з будь-яким цефалоспорином III покоління напроти диска, що містить клавуланову кислоту (синергізм в ділянці перетину зон дифузії двох дисків, розташованих на невеликій відстані один від одного). Методика приготування мікробної суспензії, інокуляції і інкубації чашок не має відмінностей від стандартного ДДМ. Особливістю методу є те, що через 5–10 хв після інокуляції на поверхню агару накладають диски з АБП: в центр — диск з клавулановою кислотою, зазвичай з комбінацією амоксицилін/клавуланат (20/10 мкг), з боків від нього на відстані 20 і 30 мм між центрами дисків — диски з цефтазидимом (30 мкг) і цефотаксимом (30 мкг). Використання двох дисків кожного АБП, розташованих на різній відстані від диска з клавулановою кислотою, дозволяє підвищити ефективність виявлення БЛРС. Якщо досліджуваний мікроорганізм продукує БЛРС, зона пригнічення росту навколо диска з цефалоспорином III покоління буде «витягнутою» у бік диска з амоксициліном/клавуланатом. Причиною цього є додаткове пригнічення росту мікроорганізму в тій зоні, куди дифундують і клавуланат, і цефалоспорин III покоління. Тест суто якісний і вимагає певних навиків при інтерпретації. Паралельно з аналізом досліджуваних культур тестують контрольні штами.

Позначення дисків: АМС — амоксицилін/клавуланова кислота (20/10 мкг), CAZ — цефтазидим (30 мкг), СТХ — цефотаксим (30 мкг), СРО — цефпіром (30 мкг).

5.3. Визначення чутливості P.aeruginosa, Pseudomonas spp., Acinetobacter spp. і інших неферментуючих бактерій (далі — НФБ). ДДМ стандартизований лише для P.aeruginosa і Acinetobacter spp. При дослідженні Stenotrophomonas maltophilia, Pseudomonas spp. (крім P.aeruginosa) і інших НФБ перевагу слід віддавати методам серійних розведень. Приблизний перелік АБП, що рекомендуються для визначення чутливості даної групи бактерій наведений в табл. 12. Оцінка антибіотикочутливості рідкісних видів НФБ вимагає індивідуального підходу.

Препарати першого ряду. Цефтазидим — один з основних АБП, що використовуються для лікування інфекцій, які викликає дана група мікроорганізмів.

Цефепім у ряді випадків зберігає активність відносно мікроорганізмів, стійких до цефтазидиму.

Гентаміцин, амікацин. Аміноглікозиди для монотерапії даної групи інфекцій не застосовуються, але є необхідним компонентом комбінованих схем терапії. Необхідність включення їх до переліку препаратів першого ряду пояснюється високою частотою стійкості до останнього антибіотика.

Ципрофлоксацин є препаратом вибору серед фторхінолонів при лікуванні даної групи інфекцій.

Меропенем та іміпенем характеризуються найбільшим рівнем активності відносно даної групи мікроорганізмів. Між ними відсутня перехресна резистентність, а тому їх доцільно включити до переліку.

Додаткові препарати. Азтреонам, цефоперазон за основними властивостями близькі до цефтазидиму.

Цефоперазон/сульбактам, тикарцилін/клавуланат — інгібітори не здатні пригнічувати активність більшості бета-лактамаз поширених серед P.aeruginosa, а тому комбіновані препарати не мають істотних переваг у порівнянні з вихідними антибіотиками. При інфекціях, викликаних Stenotrophomona maltophilia, клінічне значення має ко-тримоксазол і тикарцилін/клавуланат, оскільки мікроорганізм має природну стійкість до всіх бета-лактамів, крім тикарциліну/клавуланату.

Цефоперазон/сульбактам (а також ампіцилін/сульбактам) можуть мати значення у лікуванні інфекцій, викликаних Acinetobacter spp., оскільки сульбактам має власну активність відносно вказаного мікроорганізму.

Через токсичність і високу частоту стійкості, застосування карбеніциліну навіть для лікування інфекцій, викликаних P.aeruginosa, слід визнати недоцільним.

Граничні значення МІК антибіотиків (і відповідні діаметри зон пригнічення росту) відносно Pseudomonas spp., Acinetobacter spp. та інших НФБ, що використовуються для інтерпретації результатів оцінки антибіотикочутливості, наведені в табл. 4.

5.4. Визначення чутливості Staphylococcus spp. Перш за все необхідно тестувати препарати, які мають основне клінічне значення: бета-лактами, макроліди, фторхінолони, аміноглікозиди і ванкоміцин. Рекомендований перелік АБП для визначення чутливості Staphylococcus spp. наведений в табл. 18, критерії інтерпретації результатів визначення чутливості (граничні значення діаметрів зон пригнічення росту і МІК АБП) — в табл. 5.

Препаратами вибору для лікування стафілококових інфекцій, викликаних S.aureus і коагулазонегативними стафілококами, є бета-лактамні антибіотики. Стійкість стафілококів до цих препаратів пов'язана або з продукцією бета-лактамаз, або з наявністю додаткового пеніцилінзв'язуючого білка — ПЗБ2а. Виявлення і диференціація цих двох механізмів резистентності дозволяє прогнозувати активність усіх бета-лактамних антибіотиків без оцінки чутливості до кожного з цих препаратів. При цьому необхідно враховувати наступні закономірності:

— штами Staphylococcus spp., які не мають механізмів резистентності, чутливі до всіх бета-лактамних АБП;

— бета-лактамази (пеніцилінази) Staphylococus spp. здатні гідролізувати природні і напівсинтетичні пеніциліни, крім оксациліну і метициліну. Чутливість або резистентність до бензилпеніциліну є індикатором активності природних і напівсинтетичних аміно-, карбокси- і уреїдопеніцилінів.

— інші бета-лактами з потенційною антистафілококовою активністю (антистафілококові пеніциліни, цефалоспорини І, II і IV поколінь і карбапенеми) зберігають активність відносно бета-лактамазопродукуючих штамів;

— штами Staphylococcus spp, які мають ПЗБ2а (метицилінорезистентні), клінічно стійкі до всіх бета-лактамних АБП. Маркером наявності ПЗБ2а є стійкість до оксациліну і метициліну.

Метицилін практично повністю витіснив з клінічної практики оксацилін, відповідно з'явився термін «оксацилінорезистентність», що є повним синонімом терміну «метицилінорезистентність».

Визначення чутливості Staphylococcus spp. до бета-лактамних АБП повинне включати виконання двох тестів визначення чутливості:

— до бензилпеніциліну або виявлення продукції бета-лактамаз (пеніциліназ);

— до оксациліну або виявлення ПЗБ2а, або кодуючого його гену mесА.

Визначення чутливості до бензилпеніциліну або виявлення продукції бета-лактамаз (пеніциліназ). Для виявлення бета-лактамаз використовують диски з нітроцефіном. Нітроцефін — хромогенний цефалоспорин, який легко гідролізується під дією всіх бета-лактамаз з утворенням забарвленого продукту.

Для проведення дослідження використовують чашку, на якій оцінювали чутливість досліджуваного штаму Staphylococcus spp. до бензилпеніциліну та/або оксациліну ДДМ. З межі зони пригнічення росту навколо диска з оксациліном бактеріологічною петлею забирають незначну кількість культури і наносять на заздалегідь зволожений диск з нітроцефіном. Диск інкубують при кімнатній температурі до 1 год. Поява червоного забарвлення свідчить про продукцію бета-лактамаз досліджуваним штамом мікроорганізму. Такий штам вважають стійким до природних і напівсинтетичних пеніцилінів (за винятком оксациліну), незалежно від конкретних результатів тестування до названих АБП.

Визначення чутливості до оксациліну. При дослідженні стандартними методами необхідно враховувати деякі особливості:

— для приготування інокулюму використовують тільки прямий метод суспендування колоній;

— тривалість інкубації до обліку результатів визначення чутливості до оксациліну повинна становити не менше 24 год.

Особливості тестування ДДМ: використовують диски, що містять 1 мкг оксациліну; при обліку результатів звертають увагу навіть на одиничні дрібні колонії стафілококів, знайдені в межах зони пригнічення росту.

Особливість тестування методами серійних розведень: в ПС доцільно додавати NaCl.

Штами стафілококів, резистентні до оксациліну, вважають стійкими до усіх бета-лактамних АБП. Якщо результати дослідження суперечливі, вирішальними є результати визначення чутливості до оксациліну. Визначати чутливість стафілококів до бета-лактамних АБП, крім бензилпеніциліну та оксациліну, недоцільно.

При виявленні у стафілококів множинної резистентності при чутливості до оксациліну дослідження повторюють. Критерії оцінки резистентності до метициліну для S.aureus і коагулазонегативних стафілококів відрізняються.

При отриманні сумнівних результатів необхідно використовувати додаткові методи: скринінг на агарі (метод наведений нижче), пряме виявлення гена mесА або білка ПЗБ2а.

При виділенні пенициліно- і метициліночутливих штамів стафілококів, мікроорганізм вважається чутливим до всіх бета-лактамних АБП, а препаратами вибору будуть природні і амінопеніциліни.

При виявленні продукції бета-лактамаз і чутливості до оксациліну, мікроорганізм резистентний до природних пеніцилінів, аміно-, карбокси- і уреїдопеніцилінів, але чутливий до оксациліну, інгібіторозахищених пеніцилінів і цефалоспоринів І–ІІ поколінь, які є препаратами вибору в даному випадку. Щодо даних штамів будуть також активні цефалоспорини IV покоління і карбапенеми, проте переваг порівняно з препаратами вибору вони не мають.

При виявленні метицилінорезистентності штам вважається стійким до всіх бета-лактамних антибіотиків, для лікування необхідно використовувати препарати інших груп, препаратами вибору в цьому випадку є глікопептиди.

Додаткові методи виявлення метицилінорезистентності. Найнадійнішим методом виявлення метицилінорезистентності у стафілококів є безпосереднє визначення наявності гена mесА молекулярно-генетичними методами (за допомогою ПЛР). Крім того, розроблений метод виявлення пеніцилінозв'язуючого білка — ПЗБ2а в реакції аглютинації.

Скринінг на агарі для виявлення метицилінорезистентності є високочутливим і специфічним методом, але він може бути використаний тільки для штамів S.aureus. Для проведення скринінгу готують чашки з агаром Мюллер — Хінтона (далі — МХА), що містять 4% NaCl і 6,0 мкг/см³ оксациліну. NaCl вносять в ПС до автоклавування. Робочий розчин оксациліну додають в ПС після автоклавування і охолодження середовища до 45–50 °С. Для приготування робочого розчину оксациліну використовують субстанцію АБП з відомою активністю.

Мікробну суспензію густиною 0,5 за Мак-Фарландом (1,5 ´ 10⁸ КУО/см³) готують методом прямого суспендування з декількох однотипних ізольованих колоній стафілокока, вирощених на чашці з неселективним поживним агаром, в стерильному фізіологічному розчині. Для інокуляції чашок з агаром можна використовувати два методи: за допомогою мікропіпетки або за допомогою тампона.

1. Готують розведення 1 : 100 стандартного інокулюма (0,5 за Мак-Фарландом) для отримання бактерійної суспензії, що містить 1,5 ´ 10⁶ КУО/см³ (наприклад, додати 0,1 см³ стандартної суспензії до 9,9 см³ стерильного фізіологічного розчину). За допомогою мікропіпетки наносять краплю (10 мкл) розведеної стандартної суспензії на поверхню агару з оксациліном.

2. Стерильний ватний тампон комерційного виготовлення занурюють в пробірку із стандартизованою суспензією (0,5 за Мак-Фарландом), відтискають надлишок вологи об стінку пробірки. Культуру наносять тампоном або на обмежену поверхню (діаметром 10–15 мм), або на всю поверхню агару з оксациліном в чашці Петрі.

Штами S.aureus інкубують при температурі 35 °С протягом 24 год, а коагулазонегативних стафілококів — протягом 48 год. Після інкубації чашки ретельно переглядають в проходячому світлі:

— поява видимого росту більше 1 колонії або вуалеподібного росту на місці нанесення культури означає стійкість даного штаму до оксациліну (метициліну);

— за відсутності росту на місці нанесення культури досліджуваний штам враховується як чутливий до метициліну (оксациліну).

— при сумнівних результатах, а також для штамів, виділених від хворих з клінічно неефективною терапією і хворих з серйозними інфекціями, необхідно провести розгорнене дослідження з визначенням МІК оксациліну і гена mесА.

При дослідженні обов'язково ставлять контроль росту досліджуваних культур на МХА з 4% NaCl без оксациліну (культуру наносять так само, як на агар з оксациліном). Паралельно з досліджуваними тестують також контрольні штами метициліночутливих і метицилінорезистентних стафілококів.

Макроліди і лінкозаміди є альтернативними препаратами для лікування стафілококових інфекцій. Враховуючи закономірності перехресної резистентності між цими підгрупами препаратів у дослідження необхідно включати:

— один з представників 14- і 15-членних макролітів (еритроміцин, кларитроміцин, рокситроміцин, азитроміцин), для яких спостерігається повна перехресна резистентність між окремими представниками;

— кліндаміцин, враховуючи повну перехресну резистентність між 16-членними макролітами (спіраміцин, мідекаміцин) і лінкозамідами.

Фторовані хінолони. Нові антипневмококові представники цієї групи АБП (левофлоксацин, спарфлоксацин, моксифлоксацин і ін.) мають підвищену активність щодо Staphylococcus spp. Між ними немає повної перехресної резистентності, антипневмококові препарати часто зберігають активність щодо штамів, стійких до інших фторхінолонів.

Аміноглікозиди. При детекції стійкості до гентаміцину виділений штам слід вважати стійким до всіх аміноглікозидів. Тому гентаміцин обов'язково повинен включатися в набір для тестування. Але іноді можуть зустрічатися штами, стійкі до інших аміноглікозидів при чутливості до гентаміцину.

Ванкоміцин є одним з препаратів вибору (разом з оксазолідинонами) для лікування інфекцій, викликаних оксацилінорезистентними штамами.

Додаткові препарати. Лінезолід. Оксазолідинони є ефективними в лікуванні інфекцій, викликаних оксацилінорезистентними штамами (у т.ч. стійкими до глікопептидів), але відомо про формування стійкості до препаратів цієї групи.

Інші препарати: ко-тримоксазол, хлорамфенікол, фузидієва кислота, тетрациклін, рифампіцин. Перелічені препарати поступаються за активністю бета-лактамам, а тому їх значення у лікуванні стафілококових інфекцій, викликаних метицилінчутливими штамами, невелике, їх клінічна ефективність при цих інфекціях вивчена недостатньо.

Рифампіцин, ко-тримоксазол і фузидієву кислоту не можна рекомендувати як засіб монотерапії через високу частоту селекції резистентності в процесі лікування.

При відсутності або низькій частоті метицилінорезистентності достатньо обмежитися оцінкою чутливості до оксациліну, макролідів і, можливо, ще до 1–2 препаратів, вживаних в конкретному стаціонарі для лікування стафілококових інфекцій. У разі ж високої частоти розповсюдження метицилінорезистентності в дослідження необхідно включати широке коло антибіотиків.

5.5. Визначення чутливості Enterococcus spp. Ентерококи характеризуються природною стійкістю до багатьох АБП, тому при виділенні їх з нестерильних локусів організму, особливо у складі асоціацій, визначати їх чутливість до АБП недоцільно. Досліджувати чутливість потрібно для штамів Enterococcus spp., виділених із стерильних у нормі рідин і тканин організму, а також з сечі. Підходи до визначення чутливості цих мікроорганізмів і набори АБП для тестування розрізняються в залежності від джерела виділення штамів (табл. 16).

Бензилпеніцилін і ампіцилін є препаратами вибору для лікування ентерококових інфекцій (до цих АБП у них є перехресна резистентність). Отримані результати можна екстраполювати на інгібіторозахищені амінопеніциліни і уреїдопеніциліни. Описані випадки резистентності ентерококів до пеніцилінів, пов'язані з продукцією бета-лактамаз, тому резистентні штами слід досліджувати на продукцію пеніцилінази в тесті з нітроцефіном.

Аміноглікозіди. Ентерококи мають природну стійкість до аміноглікозидів, але ці препарати широко застосовуються в комбінованій терапії генералізованих ентерококових інфекцій у зв'язку з вираженим синергізмом між аміноглікозидами і ампіциліном або ванкоміцином.

Синергізм виявляється тільки в тому випадку, коли МІК аміноглікозидів не перевищує 500 мкг/см³ для гентаміцину і 1000 мкг/см³ для стрептоміцину, а тому необхідно проводити скринінг на наявність у ентерококів високого рівня резистентності до стрептоміцину і гентаміцину.

Ванкоміцин є препаратом вибору для лікування інфекцій, викликаних штамами, резистентними до бета-лактамів і аміноглікозидів.

Лінезолід може бути застосований для лікування інфекцій, викликаних штамами, стійкими і до ванкоміцину, і до бета-лактамів і аміноглікозидів.

Інші препарати. Для штамів ентерококів, виділених при ІСШ, доцільно досліджувати чутливість до пеніциліну або ампіциліну, фторхінолонів, тетрацикліну, нітрофуранів, фосфоміцину. Критерії інтерпретації результатів визначення чутливості Enterococcus spp. (граничні значення діаметрів зон пригнічення росту і МІК АБП) подані в табл. 6.

Скринінг для виявлення у ентерококів високого рівня резистентності до аміноглікозидів. Скринінг можна проводити на агарі або в бульйоні. Поживне середовище (агар або бульйон на серцево-мозковому екстракті) готують відповідно до інструкції виробника. Після автоклавування і охолодження до 45–50 °С у асептичне середовище додають розчини антибіотиків до наступних кінцевих концентрацій: гентаміцин для скринінгу в агарі і бульйоні — 500 мг/ дм³; стрептоміцин для скринінгу в агарі — 2000 мг/дм³, для скринінгу в бульйоні — 1000 мг/дм³.

Для скринінгу на агару на поверхню середовища наносять 10,0 мкл мікробної суспензії у концентрації 0,5 за Мак-Фарландом. Для скринінгу в бульйоні до середовища вносять інокулюм до кінцевої концентрації 5 ´ 10⁵ КУО/см³. Інкубацію проводять при температурі 35 °С, для гентаміцину — протягом 24 год, для стрептоміцину — до 48 год. Досліджуваний штам вважається резистентним за наступних умов:

— при скринінгу на агарі — ріст більше 1 колонії;

— при скринінгу в бульйоні — будь-який видимий ріст.

Для контролю якості використовують штами чутливих і резистентних ентерококів.

Скринінг для виявлення ванкоміцинорезистентності у ентерококів.

Скринінг здійснюється на агарі. Агар на серцево-мозковому екстракті, готують відповідно до інструкції виробника. Після автоклавування і охолодження до 45–50 °С у середовище асептично додають розчин ванкоміцину до кінцевої концентрації 6,0 мг/см³.

Для приготування мікробної суспензії використовують ізольовані колонії з 24-годинної культури, вирощеної на неселективних ПС, суспендують до концентрації 0,5 за Мак-Фарландом і наносять 10,0 мкл суспензії на поверхню агару. Інкубують при температурі 35 °С протягом 24 год. Досліджуваний штам вважають резистентним при рості більше 1 колонії на агарі з ванкоміцином. Для контролю якості використовують штами чутливих і резистентних ентерококів.

5.6. Визначення чутливості мікроорганізмів зі складними поживними потребами іноді вимагає паралельного використання методу серійних розведень і ДДМ, особливої ретельності у виконанні методик. Спроби навіть незначної модифікації стандартних методів (заміна дорогих реагентів на більш дешеві) можуть привести до отримання помилкових, недостовірних результатів, здатних ввести в оману і мікробіологів, і клініцистів.

При визначенні необхідності тестування чутливості мікроорганізмів цієї групи до АБП слід оцінити співвідношення вартості і ефективності (клінічної значущості) таких досліджень, а також зіставити вартість повноцінного матеріально-технічного оснащення з доступними ресурсами.

Визначення чутливості Streptococcus spp. Для визначення чутливості стрептококів використовують наступні ПС:

— для методів серійних розведень в бульйоні — бульйон Мюллер — Хінтона (далі МХБ) з додаванням 2,0–5,0% лізованої крові коня (кров лізують заморожуванням — відтаванням з подальшим центрифугуванням для звільнення від тіней еритроцитів);

— для методів серійних розведень в агарі і ДДМ — МХА з додаванням 5% дефібринованої баранячої крові.

Вказані добавки асептично вносять в поживну основу після автоклавування і охолодження до 48–50 °С Визначення чутливості Streptococcus pneumoniae. Бета-лактамні антибіотики (зокрема, бензилпеніцилін) є препаратами вибору для терапії пневмококових інфекцій, але їх клінічна ефективність залежить від джерела виділення (дихальні шляхи, ліквор). Механізм резистентності S.pneumoniae до пеніциліну та інших бета-лактамних антибіотиків обумовлений зміною пеніцилінзв'язуючих білків (ПЗБ) клітинної стінки. В результаті мутацій зменшується спорідненість ПЗБ до бета-лактамних антибіотиків.

Методологія визначення чутливості S.pneumoniae має важливі особливості: не можна визначати чутливість до бета-лактамних антибіотиків (пеніциліну, амінопеніцилінів, цефалоспоринів, карбапенемів) диско-дифузійним методом; не можна визначати чутливість S.pneumoniae до АБП методом розведень в агарі. Тому визначення чутливості пневмококів до пеніциліну і інших бета-лактамних антибіотиків передбачає виконання двох досліджень:

— скринінгу з диском, що містить 1,0 мкг оксациліну, з метою виявлення можливої пеніцилінорезистентності;

— визначення МІК пеніциліну та інших бета-лактамних антибіотикіа методом розведень у бульйоні або за допомогою Е-тесту у штамів, віднесених за результатами скринінгу до помірно-резистентних і резистентних штамів пневмококів.

Скринінг на наявність пеніцилінорезистентності у штамів S.pneumoniae. Методика проведення дослідження не відрізняється від звичайної процедури визначення чутливості пневмококів до АБП ДДМ. При виявленні діаметра зони пригнічення росту штаму пневмокока навкруги диска з 1 мкг оксациліну > 20 мм S.pneumoniae розцінюється як чутливий до всіх бета-лактамних антибіотиків. При виявленні діаметра зони пригнічення росту < 20 мм, необхідно визначати усіх β-лактамних антибіотиків (пеніциліну, амінопеніцилінів, цефалоспориназ II–IV поколінь, карбапенемів) методами серійних розведень в бульйоні або за допомогою Е-тестів.

Макроліди і лінкозаміди мають велике значення у лікуванні пневмококових інфекцій. Оцінка чутливості S.pneumoniae до цих антибіотиків можлива диско-дифузійним методом і методом серійних розведень. Зустрічаються різні варіанти перехресної резистентності мікроорганізмів до АБП цієї групи, проте для характеристики чутливості S.pneumoniae до даної групи препаратів досить оцінити чутливість до еритроміцину і кліндаміцину, що дозволяє диференціювати два основні фенотипи стійкості:

MLS_B — перехресна стійкість до всіх макролідів, лінкозамідів і стрептограмінів В, обумовлена метилуванням мішені дії препаратів;

М — стійкість до 14- і 15-членних макролідів (при збереженні чутливості до 16-членних макролідів, лінкозамідів і стрептограмінів), обумовлена активним виведенням АБП.

Традиційні фторхінолони (пефлоксацин, офлоксацин, ципрофлоксацин і ломефлоксацин) не адекватні для лікування пневмококових інфекцій, а тому оцінювати чутливість до цих препаратів недоцільно. Важливе місце у лікуванні цих інфекцій посіли антипневмококові фторхінолони (левофлоксацин, спарфлоксацин, моксифлоксацин і гатифлоксацин). Частота стійкості пневмококів до перелічених препаратів мінімальна, проте необхідно включити в дослідження всю групу фторхінолонів, оскільки до них немає повної перехресної резистентності.

АБП інших груп. З антибіотиків інших груп для лікування пневмококових інфекцій застосовують ко-тримоксазол, хлорамфенікол і тетрациклін. Проте роль перелічених препаратів останніми роками різко знижується в зв'язку наростанням стійкості, меншою клінічною ефективністю порівняно з бета-лактамами, макролідами і антипневмококовими фторхінолонами, а також значним числом небажаних ефектів.

Для лікування важких пневмококових інфекцій, викликаних штамами з високим рівнем стійкості до АБП інших груп, рекомендується ванкоміцин.

Критерії інтерпретації результатів визначення чутливості S.pneumoniae (граничні значення діаметрів зон пригнічення росту і МІК АБП) наведені в табл. 7.

Визначення чутливості Streptococcus spp. групи «viridans». Проводити визначення чутливості штамів стрептококів групи «viridans», виділених з нестерильних локусів, недоцільно. У штамів, виділених із стерильних в нормі локусів організму, необхідно, в першу чергу, досліджувати чутливість до пеніциліну. Достовірні результати визначення чутливості стрептококів групи «viridans» до пеніциліну можна отримати тільки за допомогою методу серійних розведень. Штами, чутливі до цього антибіотика, слід розцінювати як чутливі до всіх бета-лактамних антибіотиків. Частка штамів, стійких до пеніциліну, можуть зберігати чутливість до деяких цефалоспоринів III покоління (цефотаксиму і цефтріаксону).

Визначення чутливості бета-гемолітичних стрептококів. Препаратами вибору для лікування інфекцій, викликаних бета-гемолітичними стрептококами (перш за все стрептококами групи А — S.pyogenes і групи В — S.agalactiae), є бета-лактами, достовірних випадків стійкості до АБП цієї групи і до ванкоміцину не описано, а тому оцінювати чутливість до вказаних препаратів недоцільно.

Якщо штам виділено із нестерильний локусів, оцінювати чутливість слід тільки для S.pyogenes і S.agalactiae. Для бета-гемолітичних стрептококів, виділених із стерильних локусів необхідно визначати чутливість до всіх перелічених препаратів одночасно. Рекомендований перелік АБП для визначення чутливості S.pneumoniae, стрептококів групи «viridans» і бета-гемолітичних стрептококів, виділених з різних локусів організму, поданий в таб. 11. Критерії інтерпретації результатів визначення чутливості Streptococcus spp. (крім S.pneumoniae) (граничні значення діаметрів зон пригнічення росту і МІК АБП) наведені в табл. 8.

Визначення чутливості Haemophilus influenzae. Для визначення чутливості Haemophilus spp. використовують спеціальні ПС, (типу НТМ), які містять необхідні для гемофілів фактори росту. Таке середовище можна приготувати в лабораторії на основі середовища Мюллер — Хінтона:

— середовище готують на основі бульйону або агару Мюллер — Хінтона. Після розчинення основи в неї додають дріжджовий екстракт (до кінцевої концентрації 5 мг/мл) і розчин гематину (до кінцевої концентрації 15 мг/дм³). Для приготування основного розчину гематину 50 мг порошку поміщають в 100,0 см 3 0,01% NaOH (0,01 моль/дм³) і нагрівають при ретельному перемішуванні до повного розчинення. В підготовлене для авто клавуванняя середовище на 1 дм³ вносять 30,0 см³ основного розчину гематину;

— після автоклавування і охолодження основи до 48–50 °С в неї асептично вносять розчин нікотинамідаденіндинуклеотиду (НАД) до кінцевої концентрації 15 мг/дм³. Розчин НАД стерилізують фільтрацією через мембранні фільтри з розміром пір 0,45 мкм;

— при визначенні чутливості до сульфаніламідів і триметоприму в охолоджене до 48–50 °С середовище асептично вносять також розчин тимідинфосфорилази до кінцевої концентрації 0,2 од./см³.

Haemophilus spp. характеризуються природною чутливістю до більшості поширених антибіотиків, у тому числі і до бета-лактамів, за виключенням цефалоспоринів і покоління. Найбільше значення має набута резистентність до ампіциліну, обумовлена продукцією плазмідних бета-лактамаз ТЕМ-1 і ROB-1. Крім ампіциліну ці ферменти частково гідролізують цефалоспорини І покоління, але не активні відносно препаратів ІІ–ІІІ поколінь.

Описані випадки стійкості штамів Н.influenzae до ампіциліну, пов'язані зі зміною мішені дії бета-лактамних антибіотиків (пеніцилінзв'язуючих білків) або зниженням проникності зовнішньої клітинної мембрани: Ці штами отримали назву бета-лактамазонегативних ампіцилінорезистентних (далі — БЛНАР) і вважаються нечутливими до інгібіторозахищених пеніцилінів і цефалоспоринів, таких як цефаклор, цефуроксим, цефіксим і цефтибутен. До теперішнього часу не отримано клінічних штамів Н.influenzae, стійких до цефалоспоринів III–IV поколінь і карбапенемів.

Для виявлення ампіцилінорезистентності у Н.influenzae в практиці достатньо визначення чутливості до ампіциліну ДДМ і тесту на продукцію бета-лактамаз з нітроцефіном. Результати цих тестів дозволять поділити штами на ампіциліночутливі, бета-лактамазопродукуючі ампіцилінорезистентні (чутливі до інгібіторозахищених пеніцилінів і цефалоспоринів II–IV поколінь) і БЛНАР, які слід розцінювати як резистентні до інгібіторозахищених пеніцилінів і деяких цефалоспоринів. Тестування з диском, що містить інгібіторозахищені пеніциліни, наприклад амоксицилін/клавуланат, не дозволяє відрізнити БЛНАР від ампіциліночутливих штамів Н.influenzae.

Стійкість до фторхінолонів серед Н.influenzae зустрічається рідко, проте зростання кількості з підвищеними значеннями для них МІК фторхінолонів вимагає тестування вказаних АБП. Примірний перелік АБП, що рекомендуються для визначення чутливості Н.influenzae, ізольованих з різних локусів організму, представлений в табл. 17.

Критерії інтерпретації результатів визначення чутливості Н.influenzae (граничні значення діаметрів зон пригнічення росту і МІК АБП) приведені в табл. 9.

Визначення чутливості Neisseria gonorrhoeae. Для оцінки антибіотикочутливості N.gonorrhoeae слід використовувати тільки метод розведень в агарі або ДДМ. Для дослідження використовують гонококовий агар. При тестуванні карбапенемів і клавуланової кислоти необхідно використовувати добавку, яка не містить цистеїн. Агар розливають в чашки Петрі без антибіотиків для ДДМ і з додаванням АБП для методу розведень в агарі.

Достовірно не описано випадків резистентності гонококів до цефалоспоринів III покоління, цей факт дозволяє розглядати цефалоспорини III покоління (цефотаксим і цефтріаксон) як препарати вибору для лікування гонореї. Тому оцінювати антибіотикочутливість гонококів слід тільки в тих випадках, коли для лікування неможливо або недоцільно використовувати цефалоспорини III покоління. Такі ситуації складаються за наявності у пацієнтів алергії до бета-лактамів або при змішаних гонорейно-хламідійних інфекціях, а також для епідеміологічного моніторингу.

У набір для тестування N.gonorrhoeae рекомендується включати фторхінолони (офлоксацин або ципрофлоксацин), тетрациклін, спектиноміцин. Для більш повної характеристики штамів і епідеміологічного моніторингу доцільно визначати чутливість до пеніциліну і цефалоспоринів ІІ–ІІІ поколінь. Критерії оцінки антибіотикочутливості N.gonorrhoeae наведені в табл. 10.

6. Вимоги безпеки

Вимоги безпеки, загальне розташування лабораторії, а також її інфраструктура повинні відповідати державним санітарним правилам ДСП 9.9.5.-080-2002 «Правила влаштування і безпеки роботи в лабораторіях (відділах, відділеннях) мікробіологічного профілю», затвердженим постановою Головного державного санітарного лікаря України від 28.01.02. № 1.

Директор Департаменту державного санітарно-епідеміологічного нагляду А.М. Пономаренко

Директор Департаменту організації медичної допомоги населенню Р.О. Моісеєнко