Газета «Новости медицины и фармации» 18(225) 2007

З метою реалізації основних положень «Глобальної стратегії ВООЗ з стримування стійкості до антимікробних препаратів», зниження поширеності резистентних до антибіотиків мікроорганізмів, особливо в лікувально-профілактичних закладах; зниження захворюваності і летальності від інфекційних захворювань, викликаних резистентними штамами, забезпечення ефективної антимікробної терапії, удосконалення методів визначення резистентності мікроорганізмів до антимікробних засобів, що застосовуються в закладах охорони здоров'я країни, та гармонізації їх з міжнародними вимогами

НАКАЗУЮ:

1. Затвердити методичні вказівки «Визначення чутливості мікроорганізмів до антибактеріальних препаратів» (далі — методичні вказівки), що додаються.

2. Міністру охорони здоров'я Автономної Республіки Крим, начальникам управлінь охорони здоров'я обласних, Головного управління охорони здоров'я та медичного забезпечення Київської та управління охорони здоров'я Севастопольської міських державних адміністрацій, Головному державному санітарному лікарю Автономної Республіки Крим, головним державним санітарним лікарям областей, міст Києва та Севастополя, на залізничному, повітряному та водному транспорті.

2.1. Забезпечити використання в підпорядкованих закладах охорони здоров'я стандартизованих методів визначення антибіотикорезистентності, проведення систематичного аналізу поширення штамів, резистентних до дії антибіотиків, етіологічної структури інфекцій і рівнів резистентності збудників у лікувально-профілактичних закладах різного профілю згідно з затвердженими методичними вказівками.

2.2. Вжити заходи щодо забезпечення лабораторій мікробіологічного профілю необхідними діагностичними препаратами для ідентифікації мікроорганізмів, визначення їх антибіотикорезистентності, тест-штамами для внутрішньолабораторного контролю якості досліджень, впровадження системи мікробіологічного моніторингу за антибіотикорезистентністю за допомогою комп'ютерної програми WHO-5, рекомендованої ВООЗ.

2.3. Провести в 1-му кварталі 2007 року семінари з медичними працівниками з питань контролю за антибіотикорезистентістю і методам її визначення.

2.4. Забезпечити направлення штамів резистентних мікроорганізмів до Центральної санепідстанції МОЗ України для подальшого вивчення.

2.5. Інформацію про виконання цього наказу надавати до Центральної санепідстанції МОЗ України щороку до 01 березня.

3. Головному лікарю Центральної санепідстанції МОЗ України, Головному державному санітарному лікарю Автономної Республіки Крим, головним державним санітарним лікарям областей, міст Києва та Севастополя, на залізничному, повітряному та водному транспорті забезпечити систематичне, не рідше 2 разів на рік, проведення зовнішнього контролю якості досліджень з визначення антибіотикорезистентності в лікувально-профілактичних установах та закладах державної санепідслужби шляхом надання контрольних задач.

4. Головному лікарю Центральної санепідстанції МОЗ України Некрасовій Л.С., Директору науково-дослідного інституту епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського АМН України Марієвському В.Ф. (за згодою) забезпечити вивчення штамів резистентних мікроорганізмів, що циркулюють в Україні, із застосуванням методів молекулярної біології з метою аналізу механізмів резистентності і створення колекції.

5. Визнати такими, що не застосовуються на території України:

5.1. Приказ МЗ СССР от 13.03.75 № 250 «Об унификации методов определения чувствительности микроорганизмов к химиотерапевтическим препаратам».

5.2. «Методические указания по определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом диффузии в агар с использованием дисков», затверджені МОЗ СРСР 10.03.83 № 2675-83.

6. Контроль за виконанням цього наказу покласти на Директора Департаменту організації медичної допомоги населенню Моісеєнко P.O. та Директора Департаменту державного санітарно-епідеміологічного нагляду МОЗ України Пономаренка A.M.

Перший заступник Міністра, головний державний санітарний лікар України С.П. Бережнов

ЗАТВЕРДЖЕНО Наказ МОЗ України № 167 від 05.04.2007 р.

МЕТОДИЧНІ ВКАЗІВКИ «ВИЗНАЧЕННЯ ЧУТЛИВОСТІ МІКРООРГАНІЗМІВ ДО АНТИБАКТЕРІАЛЬНИХ ПРЕПАРАТІВ»

1. Загальні положення

Методичні вказівки «Визначення чутливості мікроорганізмів до антибактеріальних препаратів» (далі — методичні вказівки) підготовлені відповідно до Постанови Головного державного санітарного лікаря України від 27.05.98 № 11 «Про порядок розробки, побудови, викладення, оформлення, затвердження державних санітарних правил і норм, гігієнічних нормативів та методичних документів» і встановлюють стандартні методи визначення чутливості мікроорганізмів до антибактеріальних препаратів.

Методичні вказівки призначені для застосування в мікробіологічних лабораторіях установ охорони здоров'я.

В останні роки в усьому світі відмічається різке зростання стійкості мікроорганізмів до антибактеріальних препаратів (далі — АБП), що негативно впливає на контроль над багатьма важливими хворобами.

Резистентність збудників інфекцій до АБП веде до збільшення термінів лікування хворих, підвищує летальність і збільшує тривалість епідемій. В економічному плані ріст антибіотикорезистентності у бактерій призводить до суттєвого підвищення вартості терапії. Проблема антибіотикорезистентності мікроорганізмів визнана глобальною, і в даний час однією із стратегічних задач у всьому світі є стримування розвитку і розповсюдження антибіотикорезистентних мікроорганізмів. Тому проведення лабораторних досліджень з метою визначення чутливості мікроорганізмів — збудників інфекційних хвороб людини до АБП набуває все більш важливого значення.

Стандартні методи визначення чутливості мікроорганізмів до АБП (диско-дифузійний та серійних розведень) були розроблені у другій половині XX століття і з тих пір принципово не змінилися. Проте впровадження у клінічну практику значної кількості нових АБП і поява нових механізмів антибіотикорезистентності у мікроорганізмів вимагають більш суворої стандартизації процедури тестування, розробки нових підходів до інтерпретації результатів, впровадження сучасної системи внутрішнього контролю якості на кожному етапі дослідження.

Вивчення чутливості мікроорганізмів до АБП здійснюються для вирішення низки завдань:

— обгрунтування цілеспрямованої індивідуальної антибактеріальної терапії для лікування конкретної інфекційної хвороби;

— обгрунтування емпіричної терапії окремих нозологічних форм інфекційних хвороб в межах лікувальних установ або регіонів;

— спостереження за розповсюдженням антибіотикорезистентності в окремих установах або регіонах;

— дослідження нових хімічних сполук на наявність антибактеріальної активності.

Класифікація антибактеріальних препаратів. З урахуванням механізму дії антибіотики поділяють на три основні групи:

— інгібітори синтезу клітинної стінки мікроорганізму (пеніциліни, цефалоспорини, ванкоміцин, тейкопланін та ін.);

— антибіотики, що порушують молекулярну організацію, функції клітинних мембран (поліміксин, ністатин, леворин, амфотерицин та ін.);

— антибіотики, що пригнічують синтез білка і нуклеїнових кислот, зокрема, інгібітори синтезу білка на рівні рибосом (хлорамфенікол, тетрациклін, макроліди, лінкоміцин, аміноглікозиди) і інгібітори РНК-полімерази (рифампіцин) та ін.

На наш погляд найзручнішою для користування є класифікація за хімічною будовою.

2. Показання для дослідження чутливості мікроорганізмів до антибактеріальних препаратів

Дослідженню на чутливість до АБП підлягають чисті культури мікроорганізмів або ізольовані колонії із щільних поживних середовищ (далі — ПС) первинного посіву клінічного матеріалу. Визначення чутливості з використанням клінічного матеріалу (без виділення чистої культури) можливе тільки у виняткових випадках за умови підтвердження однорідності культури і високого ступеня обсіменіння при мікроскопії мазків, забарвлених за Грамом. При такій ситуації дослідження слід повторити після виділення чистої культури мікроорганізму.

При виявленні на щільних ПС первинного посіву змішаної культури, досліджувати антибіотикочутливість до ідентифікації і оцінки етіологічної значимості окремих мікроорганізмів недоцільно.

Разом з тим визначення чутливості виділених мікроорганізмів до АБП виправдане далеко не в усіх випадках, виявлення показань для такого дослідження є обов'язком лікаря-бактеріолога. Слід пам'ятати, що:

— визначати чутливість до АБП представників нормальної мікрофлори людини з природних місць знаходження, бактерій, виділених з об'єктів довкілля, за винятком випадків проведення досліджень для епідеміологічного типування, недоцільно;

— підтвердження природної чутливості або резистентності мікроорганізму до АБП не є завданням практичних лабораторій;

— не слід в рутинних дослідженнях вивчати мікроорганізми, для яких в даний час не стандартизовані методи визначення чутливості і відсутні критерії інтерпретації результатів. Такі результати не можуть бути підставою для призначення антибактеріального препарату;

— проводити визначення чутливості до препаратів у мікроорганізмів, що проявляють універсальну чутливість до них, тобто коли випадків резистентності не описано (наприклад, усі штами Streptococcus pyogenes, N.meningitidis чутливі до пеніциліну), недоцільно.

3. Методи визначення чутливості мікроорганізмів до антибактеріальних препаратів

Серед стандартизованих методів визначення чутливості мікроорганізмів до АБП розрізняють методи серійних розведень та дифузійні. Крім того, в даний час все більш широкого розповсюдження набувають автоматичні методи.

Методи серійних розведень базуються на прямому визначенні мінімальної інгібуючої (подавляючої) концентрації (далі — МІК) препарату, що характеризує мікробіологічну активність АБП.

МІК — мінімальна концентрація препарату, яка пригнічує видимий ріст досліджуваного мікроорганізму в бульйонній культурі або на щільному поживному середовищі.

Для визначення величини МІК певні концентрації АБП вносять у поживне середовище, яке потім засівають культурою досліджуваного мікроорганізму і після інкубації оцінюють наявність або відсутність видимого росту.

Розрізняють методи серійних розведень в агарі або в бульйоні. В залежності від об'єму використаного бульйону розрізняють методи серійних макро- і мікророзведень. В автоматизованих системах для визначення чутливості мікроорганізмів використовується метод, заснований на використанні тільки двох концентрацій АБП, які відповідають граничним значенням МІК.

В основу дифузійних методів визначення чутливості покладена дифузія АБП із носія у щільне ПС до концентрації препарату, яка перевищує МІК і пригнічує ріст досліджуваної культури в цій зоні. Існують дві основні модифікації дифузійного методу: диско-дифузійний та Е-тест.

В диско-дифузійному методі у якості носія АБП використовують паперовий диск. Утворення зони пригнічення росту відбувається в результаті дифузії АБП з носія в ПС. Диско-дифузійний метод дозволяє лише опосередковано зробити висновок про величину МІК, а результатом дослідження є віднесення мікроорганізму до однієї з категорій чутливості (чутливий, помірно стійкий або резистентний).

Е-тест — це вузька полімерна смужка (0,5 ´ 6,0 см), на яку нанесений градієнт концентрацій АБП (від мінімальних до максимальних). Пригнічення росту мікроорганізму навкруги смужки Е-тесту відбувається тільки в тій зоні, де концентрація АБП, що дифундує з носія, вище МІК, при цьому утворюється краплеподібна зона інгібіції. Значення концентрацій АБП на кожній ділянці носія нанесені на зовнішній (зверненій до дослідника) поверхні Е-тесту. Величину МІК вираховують в тому місці, де межа зони пригнічення росту впритул підходить до носія. Детальні інструкції про визначення чутливості з використанням Е-тестів додаються виробником до набору.

3.1. Основні етапи проведення тестування. Для вивчення антибіотикочутливості мікроорганізму незалежно від методу дослідження необхідно послідовно виконати такі етапи:

— приготувати поживні середовища;

— приготувати суспензії досліджуваних мікроорганізмів (інокулюма);

— внести нокулюм в поживне середовище;

— інкубувати посіви визначений проміжок часу при відповідних температурних параметрах;

— облік результатів та їх інтерпретація, формулювання рекомендацій щодо лікування.

Дифузійні методи включають також етап накладання дисків або смужок Е-тесту на щільне ПС.

3.1.1. Приготування поживних середовищ для визначення чутливості.

Для оцінки чутливості використовують спеціально призначені для цього ПС, дозволені до застосування в Україні в установленому порядку. Вид ПС для оцінки чутливості залежить від обраного методу проведення дослідження (агар або бульйон), а також мікроорганізму, що підлягає тестуванню.

Міжнародно визнаними поживними середовищами для визначення чутливості мікроорганізмів до антибіотиків є агар або бульйон Мюллер — Хінтона і середовища, приготовані на їх основі. Доведено, що середовище АГВ непридатне для визначення чутливості до багатьох сучасних антимікробних препаратів. ПС, що застосовуються, за своїми характеристиками повинні задовольняти вимогам, наведеним в розділі 4.2.

Обране ПС для визначення чутливості готують із сухого середовища промислового виробництва відповідно до інструкції виробника. Після автоклавування ПС розливають в стерильні пробірки або чашки Петрі. При необхідності колби з ПС поміщають на водяну баню при 48–50 °С, де витримують до досягнення вказаної температури, після чого в них асептично вносять термолабільні поживні добавки та/або робочі розчини антибіотиків, а потім розливають в пробірки або в чашки Петрі. Товщина агару у чашках повинна бути 4 мм, а тому на чашку діаметром 100 мм потрібно 25 см³ агару, на чашку діаметром 90 мм — 20 см³. Чашки залишають при кімнатній температурі для застигання. Приготовані таким чином чашки Петрі бажано використовувати негайно. Допускається зберігання їх в запаяних поліетиленових пакетах в холодильнику при 4–8 °С не більше 5 діб.

3.1.2. Приготування мікробної суспензії (інокулюма). Приготування мікробної суспензії досліджуваного мікроорганізму певної густини є загальною і принципово важливою вимогою для усіх методів тестування, її концентрація повинна становити 1,5 ´ 10⁸ колонієутворюючих одиниць (далі — КУО)/см³, що при візуальному контролі відповідає стандарту мутності 0,5 за Мак-Фарландом. Контроль оптичної густини суспензії може також здійснюватися денситометрично, наприклад за допомогою денситометра. Бактерійну суспензію можна готувати з бульйонної або з агарової культури.

Приготування інокулюма з агарової культури. Для приготування інокулюма відбирають 3–5 однотипних, чітко ізольованих колоній, що виросли на неселективних щільних ПС після 16–24 годин інкубації. Петлею переносять незначну кількість матеріалу з верхівок колоній в пробірку із стерильним фізіологічним розчином або поживним бульйоном, доводячи густину інокулюма точно до 0,5 за стандартом Мак-Фарланда. При наявності накопиченої біомаси чистої культури беруть повну петлю зливного росту і аналогічним чином суспендують в 4–5 ³ стерильного фізіологічного розчину/поживного бульйону. Інокулюм слід використовувати не пізніше 15 хв після приготування.

Не можна використовувати як інокулят нерозведені бульйонні культури або нестандартизований інокулюм!

Приготування інокулюма з бульйонної культури. При визначенні чутливості бактерій із звичайними поживними потребами, які швидко ростуть, для приготування інокулюма можна використовувати 5–6-годинну бульйонну культуру мікроорганізму. Для цього відбирають декілька однотипних ізольованих колоній, петлею переносять незначну кількість матеріалу в пробірку з 4,0–5,0 см³ рідкого неселективного ПС. Інкубують при 35 °С. Через 5–6 год інкубації густина мікробної суспензії приблизно відповідає необхідній, і її точно доводять до 0,5 за Мак-Фарландом, додаючи стерильний бульйон або фізіологічний розчин.

3.1.3. Приготування стандарту 0,5 за Мак-Фарландом Стандарт Мак-Фарланда може бути придбаний або приготований в лабораторії.

До 0,5 см³ розчину ВаСl₂ в концентрації 0,048 моль/дм³ (1,175% розчин ВаС1₂ ´ 2Н₂О) повільно при ретельному перемішуванні додати 99,5 см 3 розчину Н₂SО₄ в концентрації 0,18 моль/дм 3 (1%) до отримання гомогенної суспензії.

Тестування стандарту мутності проводять за допомогою фотометра. Поглинання при використанні кювети 1 см повинно становити 0,08–0,10 при довжині хвилі 625 нм.

Отриману суспензію розливають по 4–6 см³ в пробірки з кришками, що герметично закриваються. Пробірки повинні бути такого ж діаметра, як і для приготування бактерійного інокулюма. Зберігають пробірки з суспензією в темному місці при кімнатній температурі не більше 6 міс.

Перед використанням пробірки ретельно струшують і оцінюють однорідність суспензії. При появі видимих частинок пробірки не використовують. Стандарт мутності поновлюють або перевіряють його оптичну густину щомісячно.

3.2. Методи серійних розведень.

3.2.1. Приготування розчинів АБП для методів серійних розведень. Надзвичайно важливим етапом для всіх методів серійних розведень є приготування розчинів АБП. Розрізняють основні розчини АБП (придатні для зберігання) і робочі, які необхідно використовувати ex tempore для приготування ПС.

Основні розчини препарату готують із субстанції АБП з відомою активністю, лікарські форми для цього не придатні. Для зважування субстанцій використовують електронні лабораторні терези з точністю до 4-го знака, для вимірювання об'ємів — калібровані дозатори і піпетки.

Основні розчини АБП готують в концентрації 1000,0 мкг/см³ і вище. Враховуючи активність АБП, готують його наважку для базового розчину. Розрахунок наважок АБП для приготування базового розчину роблять за формулою:

де mАБ_теор. — розрахункова (теоретична) наважка АБП; С — необхідна концентрація АБП; V_теор. — об'єм розчинника для розчинення теоретичної наважки; А — активність АБП (кількість активної речовини, що міститься в субстанції).

Зважити точно розрахункову кількість порошку практично неможливо, тому готують близьку до розрахункової наважку, а потім перераховують кількість необхідного розчинника.

де V_практ. — об'єм розчинника для розчинення практичної наважки;

mАБ_практ. — отримана наважка АБП;

mАБ_теор. — розрахункова (теоретична) наважка АБП;

V_теор. — об'єм розчинника для розчинення теоретичної наважки.

АБП істотно розрізняються за розчинністю, тому виникає необхідність використовувати різні речовини для первинного розчинення препаратів (розчинники) і для доведення їх до заданої концентрації (разбавлювачі). У випадках, коли розчинники і розбавлювачі є різними речовинами, для розчинення АБП необхідно використовувати мінімальну кількість розчинника.

Основні розчини зберігають при температурі не вище –20 °С, але терміни зберігання окремих АБП при цій температурі істотно відрізняються. Оптимальними умовами для зберігання основних розчинів АБП є температура –60 °С і нижче, тривалість — не більше 6 міс. Основні розчини бета-лактамних АБП можуть втрачати активність і в більш ранні терміни.

Діставши флакони з готовими основними розчинами із холодильника, необхідно довести їх до кімнатної температури для запобігання конденсації вологи. Повторне заморожування основних розчинів не допускається.

З робочих розчинів готують двократні розведення АБП. При розрахунках за основу беруть кінцеву концентрацію АБП в ПС, яка дорівнює 1,0 мкг/см³ (більш високі — 2, 4, 8 і т.ін.; більш низькі — 0,5; 0,25; 0,125 і т.ін.). При цьому реальні концентрації розчинів повинні враховувати фактор розбавлення розчину АБП при приготуванні чашок з щільним ПС або при інокуляції. Діапазон двократних серійних розведень АБП залежить від виду мікроорганізму, що підлягає тестуванню, активності АБП і мети дослідження.

3.2.2. Метод серійних розведень в бульйоні. Метод серійних розведень в бульйоні використовують у двох основних варіантах: макрометод (пробірочний) і мікрометод (кінцевий об'єм 0,2 см 3 і менше). Макрометод може використовуватись для оцінки чутливості одиничних штамів, оскільки має низьку продуктивність.

Макрометод. Тестування проводиться в об'ємі 1 см 3 кожного розведення АБП з кінцевою концентрацією досліджуваного мікроорганізму приблизно 5 ´ 10⁵ КУО/см³. Поживний бульйон розливають по 0,5 см³ в кожну пробірку. Кількість пробірок визначається необхідним діапазоном розведень АБП і збільшується на одну для постановки «негативного контролю».

Робочий розчин АБП готують з основного розчину з використанням рідкого ПС. Концентрацію робочого розчину розраховують, виходячи з необхідної максимальної концентрації у ряді серійних розведень, враховуючи, що при подальшій інокуляції препарат буде ще розбавлений. Робочий розчин в кількості 0,5 см³ за допомогою мікропіпетки із стерильним наконечником вносять в першу пробірку, що містить 0,5 см³ бульйону. Ретельно перемішують і новим стерильним наконечником переносять 0,5 см³ розчину АБП в бульйоні в наступну пробірку з 0,5 см³ бульйону. Цю процедуру повторюють, поки не буде приготований весь необхідний ряд розведень. З останньої пробірки 0,5 см³ бульйону видаляють.

Отже, отримують ряд пробірок з розчинами АБП, концентрації яких відрізняються в сусідніх пробірках в 2 рази. Одночасно готують додаткові ряди серійних розведень АБП для тестування контрольних штамів. Серія розведень обов'язково повинна включати граничні концентрації і допустимі діапазони МІК для контрольних штамів.

Для інокуляції використовують мікробну суспензію, еквівалентну 0,5 за стандартом Мак-Фарланда, розведену в 100 разів на поживному бульйоні, після чого концентрація мікроорганізму в ній становитиме приблизно 10⁶ КУО/см³. По 0,5 см³ інокулюма вносять в кожну пробірку, що містить по 0,5 см³ відповідних розведень АБП, і в одну пробірку з 0,5 см³ поживного бульйону без антибіотика як «негативний контроль». Кінцева концентрація мікроорганізму в кожній пробірці досягне необхідної — приблизно 5 ´ 10⁵ КУО/см³. Інокулюм повинен бути внесений в пробірки з розведеннями АБП не пізніше 15 хв з моменту його приготування.

Пробірки закривають стерильними пробками, і всі, крім пробірки з «негативним контролем», інкубують в звичайній атмосфері при температурі 35 °С протягом 16–20 або 20–24 год (в залежності від виду досліджуваного мікроорганізму). Пробірка з «негативним контролем» поміщається в холодильник при 4 °С до обліку результатів.

Для визначення наявності росту мікроорганізму пробірки з посівами переглядають у проходячому світлі. Ріст культури у присутності АБП порівнюється з «негативним контролем», що містить початковий інокулюм, який зберігався у холодильнику. МІК визначається за найменшою концентрацією АБП, яка пригнічує видимий ріст мікроорганізму.

Мікрометод. Тестування проводиться в об'ємі 0,2 см³ і менше, що дозволяє значно скоротити кількість витратних матеріалів. Його перевагами є висока продуктивність і можливість тривалого зберігання заздалегідь приготованих планшетів. Методика не має технічних відмінностей від макрометоду, але вимагає оснащення лабораторії багатоканальними піпетками, стерильними 96-лунковими планшетами з кришками для імунологічних досліджень (з плоским дном). Після внесення робочих розчинів антибіотиків в лунки запаяні в поліетилен планшети можуть зберігатися при температурі –60 °С і нижче до моменту використання. Повторне заморожування — відтавання не допускається.

Перед проведенням дослідження планшети витримують до досягнення ними кімнатної температури, після чого їх інокулюють приготованою суспензією досліджуваного мікроорганізму. Під час інкубації для запобігання висихання вмісту лунок планшет обов'язково повинен бути закритий кришкою.

Облік результатів проводять візуально або спектрофотометрично, порівнюючи ріст мікроорганізму у присутності АБП із ростом культури у лунці без АБП. За МІК приймають мінімальну концентрацію, що забезпечує повне пригнічення видимого росту досліджуваного штаму.

При використанні комерційних тест-систем для дослідження антибіотикорезистентності методом серійних мікророзведень, дозволених до застосування в Україні в установленому порядку, слід користуватися інструкціями виробників.

При постановці методів серійних розведень в бульйоні необхідно проводити контроль росту культури в середовищі без АБП, чистоти суспензії мікроорганізму (шляхом висіву на неселективні середовища). Кожне тестування штамів супроводжується внутрішнім контролем якості дослідження з використанням відповідних контрольних (референтних) штамів.

3.2.3. Метод серійних розведень в агарі. Метод серійних розведень в агарі дозволяє одночасно визначити МІК партії штамів (до 30 клінічних штамів). Для дослідження висівають штами мікроорганізму на чашки Петрі з агаром, що містить послідовні подвійні розведення антибіотика. Паралельно тестують відповідні контрольні штами, а також контролюють ріст мікроорганізмів на чашках без АБП і чистоту культури.

Для приготування серійних розведень АБП з основного розчину досліджуваного препарату готують робочий розчин в концентрації, яка в 10 разів перевищує використану максимальну для конкретного дослідження. Потім готують серію двократних розведень робочого розчину. Для приготування серії розведень використовуються стерильні хімічно інертні лабораторні ємності з кришками об'ємом не менше 10 см³ (для зручності розмішування).

Поживне середовище готують відповідно до інструкції виробника. Після автоклавування колби з ПС поміщають на водяну баню при 48–50 °С, де витримують до досягнення вказаної температури, після чого в них асептично вносять 1 частину робочого розчину АБП на 9 частин розплавленого агару і, при необхідності, термолабільні поживні добавки. Середовище ретельно перемішують і розливають у чашки Петрі.

Можна готувати чашки Петрі з агаром, що містить розведення АБП, змішуючи ПС і розчин препарату безпосередньо в чашці Петрі. Для цього чашки заздалегідь маркують, вказавши препарат і його концентрацію. У стандартні пластикові чашки діаметром 90 мм вносять 2 см 3 розчину АБП і додають 18 см³ нагрітого до 50 °С рідкого агару. Ретельно перемішують агар плавними різноспрямованими круговими рухами чашки. Після приготування чашок агар повинен затвердіти в горизонтальному положенні. Не можна різко пересувати, переносити чашки до повного застигання агару. Паралельно з чашками Петрі, що містять розчини антибіотиків, для контролю росту готують чашки Петрі без антибіотиків. Чашки залишають при кімнатній температурі для застигання і підсушування на 10–12 год.

Приготовані таким чином чашки Петрі слід використовувати негайно, проте допускається зберігання в запаяних поліетиленових пакетах при 4–8 °С до 5 діб (крім чашок, що містять бета-лактамні антибіотики).

Стандартну мікробну суспензію, яка відповідає стандарту 0,5 за Мак-Фарландом розводять у 10 разів. Отриману суспензію необхідно інокулювати на поверхню агару протягом 15 хв з моменту приготування, при цьому утворюється пляма діаметром 5–8 мм. Для контролю якості приготування суспензій періодично проводять підрахунок реальних КУО шляхом висіву зразка приготованого інокулюма на неселективні поживні середовища.

Після інокуляції чашки залишають при кімнатній температурі для підсихання, перевертають їх і інкубують при температурі 35 °С протягом 18–24 год (в залежності від виду досліджуваного мікроорганізму).

Облік результатів проводять, помістивши чашку на темну поверхню, що не відбиває світло. Концентрація, що викликала повну інгібіцію видимого росту, є МІК. Для диференціювання ніжного росту від нальоту, що залишився після інокулята, доцільно використовувати стереомікроскоп. Наявність однієї колонії на чашці з концентрацією на 1 розведення вище, ніж явна МІК, можна не враховувати.

При постановці методів серійних розведень в агарі обов'язково проводять контроль росту культури на чашці Петрі з поживним середовищем, яке не містить АБП і чистоти культури. Кожне тестування штамів супроводжується внутрішнім контролем якості дослідження з використанням відповідних контрольних (референсних) штамів.

Методи серійних розведень є найточнішими і найінформативнішими, проте їх постановка в практичних лабораторіях пов'язана зі значними методичним труднощами: необхідність використання субстанцій антибіотиків з відомим рівнем активності, суворого дотримання режимів зберігання, ретельного виконання контролю якості поживних середовищ, трудомісткості приготування робочих розчинів антибіотиків.

Використання тест-систем на основі методу мікророзведень дозволяє уникати трудомістких процедур стандартизації підготовчих етапів і при цьому забезпечує отримання достовірних кількісних результатів щодо рівня антибітикорезистентності.

3.3. Диско-дифузійний метод (далі — ДДМ). Метод оснований на здатності АБП дифундувати з просочених ними паперових дисків в поживне середовище і пригнічувати ріст мікроорганізмів, посіяних на поверхні агару.

Для визначення чутливості ДДМ використовують поживні середовища такі ж, як і для методу розведень в агарі, а тому використовуються і ті ж методи контролю їх якості. Щільне поживне середовище готують відповідно до інструкції виробника, розливають у чашки Петрі шаром товщиною 4,0 ± 0,5 мм, попередньо виставивши їх на горизонтальну поверхню (вивірену рівнем, без западин і опуклостей). Це вкрай важливо, оскільки розмір і форма зони пригнічення росту залежать від глибини і рівномірності агарового шару. Чашки залишають при кімнатній температурі для застигання. Зберігати чашки можна запаяними в поліетиленові пакети при 4–8 °С протягом 5 діб. Перед інокуляцією чашки підсушують у термостаті при 35 °С з привідкритою кришкою протягом 10–20 хв. Конденсату рідини на внутрішній поверхні кришок не повинно бути.

Диски з антибіотиками. Для визначення чутливості ДДМ використовують тільки стандартизовані якісні диски. Виготовлення дисків з АБП для визначення чутливості диско-дифузійним методом в лабораторних умовах не допускається.

Достовірність результатів дослідження залежить також від умов зберігання готових комерційних дисків, оскільки вміст в них антибіотиків може знизитися нижче допустимого рівня до закінчення терміну придатності. Зберігати диски з АБП тривалий термін слід в герметичній упаковці в морозильній камері при температурі –18 °С і нижче. Невеликі партії дисків, що використовуються в повсякденній роботі, можна тримати в холодильнику при температурі 4–8 °С, щільно закупореними, щоб гарантувати неможливість попадання у флакон вологи, крім того, для додаткового захисту від вологи флакони (картриджі) з дисками комерційного виготовлення містять спеціальний вологопоглинач (силікагель). Флакони (картриджі) з дисками слід витримувати перед використанням герметично закритими до досягнення ними кімнатної температури протягом 1 години, що запобігає утворенню конденсату на дисках після відкривання флаконів.

Приготування бактерійної суспензії і інокуляція. При визначенні чутливості ДДМ використовують стандартний інокулюм, що відповідає 0,5 за стандартом Мак-Фарланда, тобто містить приблизно 1,5 ´ 10⁸ КУО/см³. Інокулюм спід використовувати протягом 15 хвилин з моменту приготування. Для інокуляції чашок з агаром можна використовувати два способи.

1. Стерильний ватний тампон (комерційного виготовлення) занурюють у підготовлену суспензію мікроорганізму, надлишок інокулюма відтискають об стінки пробірки. Інокуляцію проводять штриховими рухами у трьох напрямах, повертаючи чашку Петрі на 60°.

2. Стандартний інокулюм наносять піпеткою на поверхню чашки Петрі з поживним середовищем в об'ємі 1–2 см³, рівномірно розподіляють по поверхні похитуванням, надлишок інокулюма видаляють піпеткою. Привідкриті чашки підсушують при кімнатній температурі протягом 10–15 хв.

На поверхню ПС наносять диски з АБП. Аплікацію дисків проводять за допомогою стерильного пінцета або автоматичного диспенсора. Відстань від диска до краю чашки і між дисками повинна бути 15–20 мм, тобто на одну чашку діаметром 100 мм слід поміщати не більше 6 дисків з АБП. Диски повинні рівномірно контактувати з поверхнею агару, для чого їх слід акуратно притиснути пінцетом.

Відразу після аплікації дисків чашки Петрі поміщають в термостат догори дном і інкубують при температурі 35 °С протягом 18–24 год (в залежності від виду досліджуваного мікроорганізму). Збільшення інтервалу часу між нанесенням дисків на поверхню середовища і початком інкубації, а отже і початком росту досліджуваної культури, приводить до «переддифузії АБП» в агар і до збільшення діаметра зони пригнічення росту.

Облік результатів. Після інкубації чашки поміщають догори дном на темну матову поверхню так, щоб світло падало на них під кутом 45° (облік у відбитому світлі). Діаметр зон затримки росту виміряють з точністю до 1 мм (бажано користуватися штангенциркулем або кронциркулем).

При вимірюванні зон затримки росту орієнтуються на зону повного пригнічення видимого росту. Не спід звертати увагу на дуже дрібні колонії, які виявляються в межах зони затримки росту тільки за особливих умов освітлення або збільшення, і ледь помітний наліт біля краю зони. Винятком є результати визначення чутливості стафілококів до оксациліну, коли необхідно враховувати і найдрібніші колонії, виявлені в межах чіткої зони пригнічення росту.

Крупні колонії в межах чіткої зони пригнічення росту свідчать про наявність сторонньої мікрофлори або про гетерорезистентність популяції мікроорганізмів, в цьому випадку необхідно повторити ідентифікацію мікроорганізму, що формує цю колонію, і визначення чутливості цього штаму.

При визначенні чутливості ДДМ штамів протеїв, що рояться, зона пригнічення росту може бути затягнутою тонкою вуалеподібною плівкою, яка не заважає встановленню межі зони і не враховується при реєстрації результатів.

При визначенні чутливості до сульфаніламідів і їх комбінації з триметопримом межу зони пригнічення росту враховують на рівні пригнічення росту на 80 %. Це пов'язано з тим, що під дією цих препаратів перед повним пригніченням росту можливо завершення 1–2 циклів проліферації мікроорганізму.

Для ідентифікації і тестування чутливості мікроорганізмів до антибіотиків можна використовувати мікробіологічні аналізатори, зареєстровані і дозволені до використання в Україні.

Вибір між диско-дифузійним і автоматичним методами можна зробити у відповідності до таких критеріїв, як кількість антибіотикограм, які треба здійснити; види бактерій, що підлягають тестуванню; затрачений час та вартість. Обидва методи мають порівнювані результати при правильному використанні. Кожен із зазначених методів має свої сильні та слабкі сторони, які подані в таблиці, що наводиться нижче:

4. Контроль якості визначення чутливості

При визначенні чутливості мікроорганізмів до АБП будь-яким методом необхідно виконувати процедури внутрішнього контролю якості дослідження.

Вірогідність результатів дослідження чутливості мікроорганізмів до АБП залежить від складу ПС, відповідності реальної активності антибіотиків паспортній характеристиці (активності), дотримання стандартності виконання всіх лабораторних процедур.

Контроль якості визначення чутливості з використанням набору контрольних штамів слід проводити щоразу паралельно з тестуванням клінічних ізолятів. Проте при отриманні досить стабільних результатів контролю якості протягом хоча б одного місяця, частота контрольних досліджень може бути скорочена до 1–2 разів на тиждень. Контрольні дослідження проводять при використанні нових партій реагентів, перш за все ПС. Якщо при проведенні подібного тестування одержані результати виявляться за межами вказаних норм, необхідно повернутися до щоденного контролю якості для з'ясування причини отримання неправильних результатів.

4.1. Контроль чистоти росту культури. Інокулюм, використаний для оцінки чутливості, засівають на чашку з неселективним ПС та інкубують протягом 16–24 годин. При виявленні на неселективному середовищі змішаної культури результати оцінки антібіотикочутливості не враховують, дослідження повторюють.

4.2. Контроль якості поживних середовищ. Кожна партія щільних ПС для визначення чутливості повинна перевірятися на придатність для росту досліджуваних мікроорганізмів. Для цього використовують відповідні контрольні штами: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae.

Для приготування мікробної суспензії густиною 0,5 за стандартом Мак-Фарланда (містить приблизно 1,5 ´ 10⁸ КУО/см³) використовують добові культури вказаних мікроорганізмів, з якої готують серію послідовних розведень 1:10. Потім на приготовані чашки з відповідним ПС висівають по 0,1 см³ суспензії 10–5, 10–6, 10–7 розведень, що містять відповідно 1 ´ 10³, 1 ´ 10², 1 ´ 10¹ КУО/см³. При хороших поживних властивостях середовища повинен виявлятися ріст мікроорганізмів з 10–6, 10–7 розведень.

Для контролю росту при визначенні чутливості методами розведень (в агарі, в рідкому ПС) використовують чашки з агаром, пробірки з бульйоном, або спеціально виділені лунки мікротитрувального планшета, в які не внесений АБП.

Для контролю стерильності проводять інкубацію при 35 °С протягом 24 або більше годин репрезентативної кількості чашок з агаром з кожної партії при визначенні чутливості ДДМ; чашок з агаром або пробірок з бульйоном, які не містять антибіотиків, при тестуванні методом розведень в агарі або макророзведень в бульйоні відповідно. При визначенні чутливості методом мікророзведень контроль стерильності проводиться у спеціально виділених для цієї мети лунках мікротитрувального планшета, в які не вносять розчини антибіотиків і мікробну суспензію.

Прийнятний діапазон рН для ПС при визначенні чутливості 7,2–7,4. Якщо показник виходить за вказані межі, можливі істотні відхилення результатів визначення чутливості від належних значень. Якщо результати тестування контрольних штамів знаходяться у визначених межах, допустимо не контролювати рН приготованого ПС. При виникненні проблем з результатами тестування контрольних штамів, особливо до АБП, активність яких може істотно змінюватися під впливом рН ПС (аміноглікозиди, макроліди, тетрациклін та ін.), необхідно провести визначення рН середовища після автоклавування, внесення всіх необхідних добавок і охолодження до кімнатної температури (25 °С). Для вірогідного визначення рН використовують рН-метр з поверхнево-активним електродом, інші методи визначення рН (за допомогою лакмусового паперу, звичайного рН-метра) не повинні використовуватися, оскільки не забезпечують отримання точних результатів.

Продовження в наступному номері