Международный неврологический журнал 1(11) 2007

Клеточно-молекулярные механизмы повреждения ЦНС включают в себя нарушение активности клеточных сигнальных систем, нарушение электровозбудимости нейронов, изменение нейроноглиальных взаимодействий, индукцию апоптоза и некроза. Результатом реализации этих механизмов является необратимое повреждение клеток ЦНС или изменение их функциональной активности, клинически проявляющееся развитием сенсорной, моторной и когнитивной дисфункции. В механизмах развития последней значительная роль в настоящее время отводится нарушениям процессов синаптической пластичности, индукции запрограммированной гибели нейронов и глиальных клеток, дизрегуляции синтеза, секреции и рецепции нейротрансмиттеров [5, 6].

В числе факторов, определяющих чувствительность клеток к действию повреждающих агентов, — метаболизм никотинамидадениндинуклеотида (НАД⁺) и состояние внутриклеточного гомеостаза кальция. Метаболизм НАД⁺ в клетках нейрональной природы является объектом контроля и регуляции [8], коль скоро состояние пула внутриклеточного НАД⁺ влияет на метаболическую активность, репликацию и репарацию ДНК, устойчивость к окислительному стрессу, электровозбудимость нейронов [7]. Уровень НАД⁺ в нейронах определяется активностью НАД⁺-синтезирующих ферментов, НАД⁺-регенерирующих метаболических путей, а также НАД⁺-конвертирующих ферментов: АДФ-рибозилтрансфераз, поли(АДФ)-рибозилполимеразы, а также АДФ-рибозилциклазы / НАД-гликогидролазы / CD38. Молекула CD38 обладает бифункциональной активностью, катализирует образование циклической АДФ-рибозы (цАДФР) и адениндинуклеотидфосфата никотиновой кислоты, выполняющих функцию мобилизаторов кальция из внутриклеточных депо, а также модуляторов активности калиевых ионных каналов М-типа в клетках нейрональной природы [7]. АДФ-рибозилциклаза является компонентом клеточных сигнальных систем, сопряженных с рецепторами ряда нейротрансмиттеров (брадикининовые, адренергические, пуринергические, гистаминовые, мускариновые ацетилхолиновые и другие). Ферментативная активность АДФ-рибозилциклазы / CD38 контролируется многими факторами, в частности структурой каталитического центра и сохранностью сульфгидрильных остатков цистеина в его пределах, уровнем внутриклеточных АТФ и НАДН, внутриклеточной локализацией фермента (плазматическая мембрана, митохондриальная мембрана, ядерная мембрана, цитозоль), конформационной пластичностью и способностью формировать димеры в мембране для эффективного транспорта продукта реакции, действием лигандов [7, 10, 12].

Противоречивыми остаются данные об изменении активности CD38 в электровозбудимых тканях при ишемии и реперфузии. В частности, в некоторых условиях регистрируется снижение продукции цАДФР при ишемии кардиомиоцитов, в то время как в других условиях определяется увеличение пула цАДФР при ишемии, например, гипоксия гладкомышечных клеток легочных артерий сопровождается увеличением активности фермента [2, 10, 13]. Показано, что открытие мегаканалов в мембранах митохондрий при апоптозе или повреждении кардиомиоцитов при ишемии сопровождается высвобождением в цитоплазму значительного количества НАД⁺ с последующей активацией фермента и продукцией цАДФ-рибозы [10].

Целью работы явилось изучение особенностей изменения активности АДФ-рибозилциклазы и развития когнитивного дефицита после острой ишемии головного мозга в эксперименте.

Материал и методы

Моделирование острой ишемии головного мозга in vivo осуществлялось на белых беспородных крысах-самцах массой 220–240 г, содержащихся в стандартных условиях вивария с соблюдением правил гуманного обращения с животными. Критерием включения в группы наблюдения было нормальное исходное состояние неврологического статуса и когнитивных функций (до проведения эксперимента): 0 баллов — по шкале Neurological Severity Scores (NSS), менее 15 с — по тесту «Водный лабиринт Морриса».

Группы наблюдения: 1) контрольная группа (n₁ = 5): введение ингаляционного анестетика (фторотан) для исключения влияния общей анестезии на характеристики оцениваемых биохимических и иммуногистохимических параметров; 2) экспериментальная группа (n₂ = 30): моделирование острой фокальной ишемии головного мозга осуществлялось анестезированным животным (фторотан — ингаляционно) путем экстравазальной окклюзии (перевязки лигатурой) правой общей сонной артерии (ОСА) [11, 15] с последующей оценкой всех тестируемых параметров через 24, 48 и 168 часов после эксперимента. У животных всех тестируемых групп оценивался неврологический статус по стандартной шкале NSS в остром и подостром постишемическом периодах. Через 24, 48 и 168 часов (7 суток) с момента индукции острой фокальной ишемии головного мозга животные умерщвлялись и осуществлялся забор образцов ткани головного мозга (лобная и затылочная области ишемизированного и контрлатерального («интактного») полушарий) с последующей гомогенизацией образцов ткани.

Оценка ферментативной активности АДФ-рибозилциклазы нейронов осуществлялась флуориметрическим методом с использованием флуорогенного субстрата — никотинамидгуаниндинуклеотида (НГД) согласно стандартному протоколу. Гомогенизация образцов ткани осуществлялась при 4 °С, в полученном гомогенате определялись концентрация белка по стандартному протоколу (MicroLowry test, Sigma, USA) и активность фермента путем инкубации 100 мкл гомогената ткани с реакционной смесью, содержащей 100 мкм НГД в 20 мМ трис-HCl (рН 7,4), в течение 20 минут при 37 °С. Регистрация флуоресценции супернатанта осуществлялась на 0-й и 20-й минутах инкубации на спектрофлуориметре СМ2203 (Solar, Belarus) при длине волны возбуждения 300 нм и длине волны испускания 410 нм. Активность фермента вычислялась по разнице амплитуды флуоресценции на 20-й и 0-й минутах инкубации, отнесенной к мг белка ткани в минуту.

Детекция CD38 в клетках головного мозга осуществлялась в замороженных фиксированных срезах головного мозга по стандартному протоколу иммуногистохимического исследования с использованием антител к CD38 («Сорбент», Москва). В силу наличия высокой гомологии CD38 человека, крысы, мыши [9] вследствие высокой консервативности последовательности этого белка мы использовали антитела к антигену человеческого происхождения. После инкубации срезов с первичными антителами (1 : 50, 2 часа при температуре 37 °С) и вторичными FITC-мечеными антимышиными антителами (1 : 200, 1 час при температуре 4 °С) визуализация комплекса «антиген-антитело» осуществлялась при люминесцентной микроскопии (увеличение х 900) с подсчетом относительного количества клеток, экспрессирующих антиген в мембранной или примембранной области или в цитоплазме диффузно.

Оценка степени выраженности неврологического дефицита у экспериментальных животных осуществлялась с использованием Международной шкалы Neurological Severity Scores (NSS) для лабораторных животных (крыс), которая градуировалась от 0 (нормальный неврологический статус) до 18 баллов (максимальный неврологический дефицит). Шкала NSS позволила исследовать в динамике состояние моторной, рефлекторной, координаторной и сенсорной функций у наблюдаемых крыс до и после экстравазальной окклюзии ОСА (табл. 1).

Оценка выраженности постишемической когнитивной дисфункции у лабораторных животных осуществлялась с использованием стандартного теста «Водный лабиринт Морриса» как метода, позволяющего оценить пластичность обучения (пространственную память, эквивалентную эпизодической памяти человека), регулируемую преимущественно гиппокампом [15]. Крысы помещались в водный лабиринт (глубина 25 см), наполненный водой (температура 30 °С) с добавлением сухого молока для достижения непрозрачности. Платформа 10 см в диаметре помещалась в одном из фиксированных квадрантов бассейна так, чтобы уровень платформы был на 1 см ниже уровня воды. Два фиксированных источника света (ориентиры) помещались в лаборатории для ориентации крыс в бассейне. Исследователь всегда находился на фиксированной позиции относительно бассейна. В один день осуществлялось 4 попытки (всего 12 попыток в течение 3 дней), временной промежуток между попытками составил 1 час. В течение каждой попытки крыса помещалась в одну из 4 фиксированных стартовых точек («север», «юг», «восток», «запад» в каждом из квадрантов бассейна), регистрировалось время, которое требовалось крысе для достижения платформы. На платформе крыса оставалась 20 секунд. Через день расположение платформы менялось и оценивалось время нахождения крысой нового расположения платформы.

Основным достигаемым диагностическим критерием нормального состояния когнитивных функций у крыс при использовании теста «Водный лабиринт Морриса» было достижение скрытой под водой платформы за 15 и менее секунд. До проведения диагностического оценочного теста осуществлялась тренировка (обучение) наблюдаемых животных в течение трех последовательных дней.

Статистический анализ полученных результатов включал методы статистического описания и проверки статистических гипотез. В пределах каждой выборки определяли среднее значение, среднее квадратичное отклонение, ошибку среднего. При условии соответствия нормальному закону распределения оценку достоверности различий осуществляли с использованием t-критерия Стьюдента и Т-теста. Статистическая обработка результатов произведена с помощью пакетов прикладных программ STATISTICA v. 6.0 и BIOSTATISTICA.

Результаты и обсуждение

Моделирование острой ишемии путем односторонней окклюзии общей сонной артерии позволило оценить особенности изменения метаболизма в ткани головного мозга как в ипсилатеральном, так и в контралатеральном стороне окклюзии полушарии с учетом допущения вероятности развития реципрокных патологических процессов в нем при ишемии противоположного региона мозга. Анализ неврологического статуса экспериментальных животных по стандартной шкале NSS подтвердил эффективность используемой модели для достижения эффекта острой ишемии полушария головного мозга и последующего развития моторной и когнитивной дисфункции.

При оценке активности АДФ-рибозилциклазы / CD38 в лобной и затылочной долях головного мозга контрольных животных, которым для исключения вероятности влияния общего анестетика на активность тестируемого фермента была осуществлена аналогичная экспериментальной группе анестезия, мы обнаружили, что суммарная активность АДФ-рибозилциклазы / CD38 достоверно не отличается в указанных областях мозга и составляет 0,118 ед/мг ткани/мин и 0,115 ед/мг ткани/мин для лобной и затылочной областей соответственно (Р > 0,05).

Мы обнаружили, что в ткани головного мозга в зоне ишемии регистрируются динамические изменения активности АДФ-рибозилциклазы / CD38, при этом наблюдаются однонаправленные изменения ферментативной активности в лобной и затылочной областях пораженного полушария. Так, к 24-му часу острой ишемии у животных было зарегистрировано достоверное увеличение активности АДФ-рибозилциклазы в обеих зонах пораженного полушария (P < 0,05 и Р < 0,01 в лобной и затылочной областях соответственно по сравнению с контролем), тогда как к 48-му часу периода ишемии мы обнаружили уменьшение активности фермента до исходного уровня (рис. 1).

Вместе с тем интересным представляется тот факт, что у части животных (40 %) в ишемизированном полушарии головного мозга к 24-му часу периода ишемии как в лобной, так и в затылочной областях отмечалось возрастание лаг-периода активации фермента, регистрируемое по запаздыванию инициации ферментативной реакции, оцениваемой по накоплению флуоресцирующего продукта. Это позволяет предположить, что увеличенная активность фермента, регистрируемая в пораженном полушарии головного мозга к 24-му часу периода ишемии, может быть ассоциирована с конформационными изменениями в молекуле фермента и/или биодоступности субстрата реакции.

В то же время к 48-му часу периода ишемии у животных в ишемизированном полушарии в 50 % случаев регистрировалось полное отсутствие активности фермента. Такого рода феномен не был зарегистрирован ни в одной из других исследованных групп. Обнаружение этого факта позволяет сделать предположение о необратимой инактивации или снижении экспрессии АДФ-рибозилциклазы в клетках головного мозга на 2-е сутки после перенесенного цереброваскулярного поражения.

Необходимо отметить, что в контрлатеральном полушарии, не испытавшем состояние острой ишемии, мы зарегистрировали достоверные изменения ферментативной активности, свидетельствующие о ее прогрессивном снижении на протяжении всего анализируемого периода. При этом в отличие от пораженного полушария мы не зарегистрировали увеличение активности фермента ни в одном из тестируемых временных промежутков.

Таким образом, результаты определения активности АДФ-рибозилциклазы в ткани головного мозга при остром ишемическом поражении свидетельствуют о том, что к 24-му часу развития ишемического повреждения продукция циклической АДФ-рибозы в клетках головного мозга существенно возрастает. Одним из наиболее вероятных механизмов увеличения активности АДФ-рибозилциклазы в раннем ишемическом периоде является увеличение количества НАД⁺ в цитозоле в результате его высвобождения из митохондриального матрикса при нарастающей митохондриальной дисфункции и открытии МРТ-мегаканалов в мембране митохондрий, как это было описано ранее в кардиомиоцитах [10].

Анализ экспрессии CD38 в срезах головного мозга контрольных животных продемонстрировал наличие CD38-иммунопозитивного материала как в лобной, так и в затылочной областях головного мозга. В задачи настоящего исследования не входила оценка популяционной принадлежности клеток, экспрессирующих CD38, однако данные литературы позволяют сделать вывод о том, что это могут быть клетки как нейрональной, так и глиальной природы, в частности астроциты. Анализ CD38+ клеток в препаратах, полученных из обеих тестируемых зон головного мозга контрольных животных, показал их сопоставимое количество как в лобной, так и в затылочной областях (17,4 ± 7,4 и 16,8 ± 6,5, соответственно). Иммунопозитивный материал располагался преимущественно диффузно в цитоплазме клеток, регистрировался в перикариальной области, а также по ходу отростков нервных клеток, что соответствует литературным данным об особенностях экспрессии CD38 в клетках головного мозга [7, 14].

В динамике ишемического поражения головного мозга было зафиксировано изменение экспрессии CD38. В частности, мы обнаружили достоверное увеличение количества CD38+ клеток в затылочной и лобной областях мозга к 24-му часу постишемического периода. При этом характер распределения иммунопозитивного материала в клетках существенно не менялся. К 48-му часу после экспериментальной окклюзии общей сонной артерии мы зарегистрировали нарастание количества клеток, экспрессирующих CD38 диффузно в цитоплазме и перинуклеарно, а также по ходу отростков. При этом степень увеличения экспрессии фермента в лобной и затылочной областях головного мозга не отличалась (табл. 2).

Интересным представляется то, что мы зарегистрировали отсутствие различий в направленности и степени выраженности изменений экспрессии CD38 в тестируемых регионах мозга на фоне существенных отличий в динамике ферментативной активности в лобной и затылочной облястях мозга в остром и подостром постишемическом периоде. Это позволяет высказать предположение о том, что изменения активности АДФ-рибозилциклазы в динамике развития постишемического повреждения ткани головного мозга ассоциированы не с изменением экспрессии фермента в клетках, а в большей степени с изменением соотношения его различных по субклеточной локализации изоформ или изменением каталитической активности.

Через 24 часа после односторонней экстравазальной окклюзии ОСА у крыс экспериментальной группы были зарегистрированы синдром Горнера (птоз, миоз, энофтальм) и оптико-пирамидный синдром в виде амблиопии на ипсилатеральной окклюзии ОСА стороне в сочетании с контралатеральным центральным гемипарезом и гемигипостезией (Р < 0,001). Выраженность постишемического неврологического дефицита (по шкале NSS) у наблюдаемых нами животных была умеренной и в 60 % наблюдений сопровождалась нарушением моторной функции (передвижения), в 90 % — нарушениями координации движений (динамической и статической атаксией). Негрубое статистически значимое нарастание выраженности неврологического дефицита прослеживалось в течение первых 48 часов после проведения эксперимента (Р < 0,01), после чего состояние наблюдаемых стабилизировалось (рис. 2, табл. 3). При динамическом обследовании состояния моторной, рефлекторной, координаторной и сенсорной сфер (по шкале NSS) через 168 часов (7 суток) постишемического периода дальнейшего статистически значимого нарастания выраженности неврологического дефицита не выявлено (Р > 0,05).

Однако при динамической оценке состояния когнитивных функций, несмотря на стабилизацию состояния мозгового кровотока и неврологического статуса на 7-е сутки, отмечена обратная картина (рис. 3, табл. 4). Появление негрубой (статистически незначимой) когнитивной дисфункции отмечено через 24 часа после односторонней экстравазальной окклюзии ОСА лишь у 2/10 (20 %) крыс (Р > 0,05). Однако спустя 48 часов после окклюзии показано статистически значимое нарастание постишемической когнитивной дисфункции у 4/10 (40 %) животных (Р < 0,001), при этом нами отмечена тенденция к неуклонному прогрессированию когнитивных расстройств в виде нарушений краткосрочной и долгосрочной памяти, обучаемости у подавляющего большинства наблюдаемых крыс в подостром постишемическом периоде (Р < 0,01): через 168 часов (7 суток) после окклюзии постишемическая когнитивная дисфункция была выявлена у 7/10 (70 %) животных, что может быть обусловлено запуском отсроченной нейрональной гибели (апоптоза) после эпизода фокальной острой ишемии головного мозга, что коррелирует с доступными литературными данными [3].

Патофизиологическая значимость нарушения активности CD38 / АДФ-рибозилциклазы заключается в участии фермента и продукта его каталитической активности в регуляции функционирования поврежденных клеток нейрональной и глиальной природы. Прежде всего, наши данные соответствуют существующим представлениям о функционировании CD38 в качестве редокс-сенсора, который фактически сопрягает изменения клеточного редокс-потенциала (в том числе при гипоксии) и механизм высвобождения кальция из внутриклеточных депо [12]. Вероятно, неконтролируемое возрастание концентрации кальция в цитозоле клеток, в том числе обусловленное нарушением кальцийдепонирующей функции митохондрий и эндоплазматического ретикулума при гипоксии, может стать причиной необратимого повреждения клетки.

Кроме того, известно, что увеличение экспрессии CD38 на астроцитах характерно для развития т.н. «глутаматного удара», в том числе ишемического генеза, когда глутамат, высвобождающийся из нейронов, стимулирует экспрессию фермента на глиальных клетках, что в свою очередь приводит к стимулированию образования цАДФ-рибозы и нарушению механизмов внутриклеточного депонирования кальция в астроцитах [2].

Обнаруженное нами уменьшение активности АДФ-рибозилциклазы в ткани мозга к 48-му часу развития ишемии может косвенно свидетельствовать о снижении количества субстрата реакции (НАД⁺), например вследствие гиперактивации альтернативного НАД⁺-утилизирующего процесса, катализируемого поли(АДФ)-рибозилолимеразой вследствие активации процессов репарации поврежденной ДНК [4].

Наши данные соответствуют данным о функционировании CD38 в качестве редокс-сенсора, который фактически сопрягает изменения клеточного редокс-потенциала (в том числе при гипоксии) и механизм высвобождения кальция из внутриклеточных депо [1, 41]. Вероятно, неконтролируемое возрастание концентрации кальция в цитозоле клеток, в том числе обусловленное нарушением кальцийдепонирующей функции митохондрий и эндоплазматического ретикулума при гипоксии, может стать причиной необратимого повреждения клетки.

Кроме того, полученные нами данные расширяют представление о роли СВ38 / АДФ-рибозилциклазы как основного регулятора внутриклеточного метаболизма НАД⁺ [1] и о патогенетической значимости нарушения активности и экспрессии этого фермента в динамике постишемического периода в клетках центральной нервной системы, в том числе с позиции развития неврологического и в частности когнитивного дефицита.

Известно, что в настоящее время протоколы нейропротекции, ориентированные на достижение адекватного уровня НАД и контролируемого ионного гомеостаза в нейронах, апеллируют преимущественно к модуляции активности поли(АДФ)-рибозилполимеразы [4]. Полученные нами данные создают предпосылки для разработки и внедрения принципиально новой технологии нейропротекции, базирующейся на направленной регуляции экспрессии и активности АДФ-рибозилциклазы нейронов головного мозга.

Статья поступила в редакцию 14.11.2006 г.