Газета «Новости медицины и фармации» 3(308) 2010

В статье белорусских авторов представлены результаты исследования влияния Гроприносина (инозин пранобекс производства Гродзиского фармацевтического завода «Польфа» Сп. з.о.о., Польша, группа «Рихтер Гедеон») на вирусы гриппа, в том числе и штамм H1N1. В Украине инозин пранобекс производства Гродзиского фармацевтического завода «Польфа» Сп. з.о.о., Польша, группа «Рихтер Гедеон», зарегистрирован под торговым названием «Гропринозин» и хорошо известен читателям.

Грипп и другие острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ) — наиболее социально значимые, распространенные и массовые заболевания, занимающие ведущее место в структуре инфекционных болезней [2, 7]. В период подъема респираторной заболеваемости на долю ОРВИ приходится 10–15 % временной нетрудоспособности населения, в остальное время года они составляют до 40 % всех заболеваний среди взрослых и более 60 % — среди детей [1, 11]. Во время эпидемии грипп поражает от 5 до 15 % всего населения. При пандемиях, когда возникает резкое изменение свойств вируса, риск заболевания имеет каждый второй человек [5]. Дети болеют гриппом в 4,6 раза чаще, чем взрослые [9]. Смертность от гриппа и его осложнений занимает первое место в структуре смертности среди всех инфекционных и паразитарных заболеваний [7, 14].

По данным ВОЗ (2008), каждый год во время вспышек гриппа в мире заболевает 3–5 млн человек и 250–500 тыс. из них умирают от осложнений [9, 12]. В Беларуси за период эпидемии от 5,1 до 17,8 % населения контрольных городов переносит грипп, при этом дети до 14 лет составляют от 36 до 56 % [3].

Известны три типа вирусов гриппа: А, В и С, которые отличаются по содержанию отдельных протеинов. Внешняя оболочка вируса гриппа состоит из двух основных гликопротеидов, один из которых обладает гемагглютинирующей (Н), а другой — нейраминидазной ферментативной активностью (N). Уникальная особенность вируса А — постоянная изменчивость поверхностных антигенов (Н и N). Точечные мутации в геноме (антигенный дрейф) приводят к появлению новых сероваров вируса, следствие этого — ежегодные вспышки и эпидемии гриппа.

Первые упоминания о гриппе были отмечены много веков назад: еще в 412 г. до н.э. гриппоподобное заболевание описал Гиппократ. С тех пор вирус периодически вызывает многочисленные пандемии. Первая документированная пандемия гриппа, унесшая много жизней, случилась в 1580 г. Печально известная «испанка» 1918–1920 гг., вызванная вирусом Н1N1, унесла, по самым скромным подсчетам, более 20 миллионов жизней. Не­обычной особенностью «испанки» было то, что она часто поражала молодых людей (обычно от гриппа в первую очередь страдают дети и пожилые лица). В 1957–1958 гг. случилась пандемия, которая получила название «азиатский грипп». Она была вызвана вирусом Н2N2,

быстро распространилась по всему миру и унесла от 1 до 1,5 миллион человек. В 1968–1969 гг. произошел средний по тяжести «гонконгский грипп», вызванный вирусом H3N2. В 1977–1978 гг. была относительно легкая по степени тяжести пандемия, названная «русским гриппом». Вирус гриппа Н1N1, вызвавший эту пандемию, уже был причиной эпидемии в 50-х годах. Поэтому в первую очередь пострадали лица, родившиеся после 1950 г.

Недавно перед учеными всего мира стояла проблема появления новой эпидемии — птичьего гриппа, вызванного вирусом Н5N1. А уже 25 апреля 2009 года Всемирная организация здравоохранения сообщила о вспышке инфекционных заболеваний, вызванных вирусом гриппа свиного происхождения — А(Н1N1), первоначально зарегистрированных в США и Мексике, как о медицинском событии международного значения — в соответствии с Международными медико-санитарными правилами 2005 г.

Ежегодно активность вируса гриппа оценивается национальными отделениями ВОЗ по изучению этой инфекции. Определяются время и место циркуляции тех или иных подтипов вируса, степень их активности и особенности течения вызванной ими инфекции, изучаются новые антигенные варианты вируса. На основании полученных результатов ВОЗ дает рекомендации по профилактике, лечению и ограничению распространения гриппа в предстоящем сезоне [7, 10, 13].

Цель исследования — анализ эпидемиологических и клинико-лабораторных особенностей гриппа у детей, определение тактики терапии.

В 2008 г. в Городской детской инфекционной клинической больнице (УЗ «ГДИКБ») г. Минска (гл. врач И.В. Юркевич) было госпитализировано 10 058 больных с клиническими признаками острой респираторной патологии, что составило 52,2 % от всех пациентов. В вирусологической лаборатории УЗ «ГДИКБ» (зав. лабораторией Н.Л. Клюйко) исследовано 7884 мазка из носоглотки на наличие антигенов респираторных вирусов (грипп А и В, парагрипп, аденовирус, RS-вирус) с помощью реакции иммуно­флюоресценции (РИФ), известной как метод экспресс-диагностики. Забор материала для исследования у всех детей производили в первые 3 дня от начала заболевания.

В структуре уточненной вирусной природы преобладали RS-вирусы (5,4 %), вирусы гриппа А (2,8 %), парагриппа (2 %), аденовирусы (1,7 %) и вирусы гриппа В (0,2 %) (рис. 1).

Проанализировано 347 историй болезни с верифицированным методом РИФ «грипп». Было установлено, что преобладал вирус гриппа А — 326 случаев (94 %). Грипп В выявлен у 21 больного (6 %).

Антиген вируса гриппа А выделялся на протяжении всего года с пиком в период эпидемического подъема заболеваемости ОРИ, а вируса гриппа В — в течение года в виде спорадических случаев (рис. 2).

В 2009 г. под наблюдением находилось 80 пациентов в возрасте до 18 лет (70 % — грипп А и 30 % — грипп В): в возрасте до 1 года — 17 %, 1–3 года — 31 %, 4–6 лет — 20 %, 7–14 лет — 16 % и старше 14 лет — 16 % (рис. 3). Таким образом, преобладали дети дошкольного возраста. Дети первых 3 лет жизни (их было 48 %) наиболее уязвимы, что объясняется как анатомо-физиологическими особенностями дыхательных путей в этом возрасте, так и тропностью вируса гриппа.

Верификация диагноза проводилась на основании исследования мазков из носоглотки на наличие антигена вируса гриппа с помощью РИФ в 63 % случаев, ПЦР-диагностики — в 29 % случаев, двумя методами — у 8 % больных.

В 81 % случаев в стационар больные поступали в течение первых 2 суток от начала заболевания с симптомами интоксикации разной степени выраженности. У 76 больных (95 %) заболевание начиналось остро: с повышения температуры тела, причем у 89 % детей — до фебрильных цифр (39,00 ± 0,15 °С), длительность лихорадки составила 4,0 ± 0,3 дня (от 1 до 9). Кроме того, дети предъявляли жалобы на общую слабость, недомогание, головную боль, боль в мышцах, глазах (в основном дети старше 5 лет). Судорожный синдром на фоне подъема температуры до фебрильных цифр имели 9 % больных гриппом А и 4 % — В. Среди клинических проявлений наряду с симптомами интоксикации у пациентов отмечался респираторный синдром. Поражение носоглотки в виде гиперемии зева и/или заложенности носа с последующим появлением слизистого отделяемого наблюдалось у 37 больных (46,2 %). У 18,8 % пациентов с клинической формой заболевания был ларинготрахеит, сопровождавшийся стенозом гортани, который в 64 % случаев носил компенсированный характер. Поражения трахеи и бронхов наблюдались у 28 больных (35 %), из них 6 больных (гриппом А) имели явления обструктивного бронхита.

В общем анализе крови больных (с учетом возрастных норм) отмечались: лейкоцитоз 13,40 ± 0,58 х 109/л — 32 % случаев, лимфоцитоз от 50 до 81 % (65,0 ± 2,3 %) — у 22,5 % больных, палочкоядерный сдвиг (ПЯС) формулы влево от 6 до 34 % — 50 % наблюдений и лейкопения 4,20 ± 0,16 х 109/л — 21,2 % (рис. 4). Изменения в гемограмме воспалительного характера можно объяснить как наличием сопутствующей патологии и осложнений (причем достоверно чаще (р < 0,005) у больных гриппом В) в виде острого среднего отита, тонзиллита, пневмонии, гнойного ринофарингита (15 %), так и выраженностью токсикоза на момент поступления в стационар. В большинстве случаев при повторном взятии анализа крови наблюдались снижение (нормализация) количества лейкоцитов и развитие лимфоцитоза. При этом достоверно чаще (р < 0,01) в общем анализе крови лейкоцитоз отмечался у больных гриппом А. Это можно объяснить тем, что дети из этой группы поступали в стационар в основном в 1-й день болезни с выраженными признаками интоксикации.

Длительность стационарного лечения этой группы больных составила от 1 до 26 дней (в среднем 6,05 ± 1,30 дня), при этом 12,5 % детей были выписаны из стационара по настоянию родителей.

Наличие фебрильной лихорадки, признаков интоксикации, осложнений и воспалительных изменений в гемограмме послужили поводом к назначению антибактериальной терапии у 45 % больных гриппом А и у 67 % — гриппом В. Ее длительность составила 4,75 ± 0,42 и 5,10 ± 0,64 дня соответственно.

В связи с возросшей проблемой возникновения в мире эпидемии гриппа остро стоит вопрос противовирусной терапии больных [3–5]. В настоящее время для лечения и профилактики гриппа используются препараты двух групп:
— ингибиторы М2-каналов (римантадин, амантадин);
— ингибиторы нейраминидазы (озельтамивир, занамивир).

Недостатки препаратов из группы ингибиторов М2-каналов: неэффективность при гриппе В, наличие ряда противопоказаний и нежелательных реакций. Кроме того, их широкое применение привело к появлению большого числа устойчивых штаммов вирусов гриппа в ряде стран. Более эффективны современные противовирусные препараты — ингибиторы нейраминидазы, но их применение ограничено по возрасту (в нашей стране нет зарегистрированных форм для детей дошкольного возраста) и высокой стоимостью. Учитывая высокую скорость мутирования вирусов гриппа А, приводящую к появлению новых пандемических штаммов, а также способствующую формированию резистентности к классическим противогриппозным препаратам — ингибиторам М2-белка и нейраминидазы, поиск новых противогриппозных препаратов весьма актуален [4, 8, 10, 11].

Было изучено влияние инозина пранобекса (Гроприносин), известного иммуномодулирующего препарата с противовирусной активностью, на репродукцию вирусов гриппа в культуре клеток МDСК.

Материалы и методы

Исследования проводили в культуре клеток МDСК (культура клеток почки собаки породы кокер-спаниель). Клетки выращивали до образования полного монослоя в 96-луночных планшетах. В качестве среды роста использовали среду ДМЕМ, содержащую 5–7 % инактивированной сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота (Sigma, США).

В экспериментах использовали штаммы сезонных вирусов гриппа А/Минск/108/09 (H3N2), А/Минск/124/08 (Н1N1), В/Минск/119/09 и штамм пандемического вируса гриппа А/Минск/94/09 (H1N1)-р, выделенный от больного, у которого инфицирование пандемическим вирусом гриппа подтверждено методом ПЦР в режиме реального времени.

Цитотоксичность препарата оценивали визуально по состоянию клеточного монослоя. За максимально переносимую концентрацию (МПК) принимали 1/2 дозы препарата, которая не оказывала цитотоксического действия после 72 ч инкубации [6].

Противовирусный эффект препарата оценивали путем титрования вирусов гриппа в 96-луночных планшетах с монослоем культуры клеток МDСК в присутствии препарата и без внесения препарата. В работе использовали 10-кратные разведения вирусов (1 : 10, 1 : 100 и т.д.) и концентрации препарата (100, 50, 25, 12 и 6 мкг/мл). Разведения препарата и вирусов для проведения исследования готовили на среде ДМЕМ, содержащей 2 мкг/мл ТРСК-трипсина (Sigma, США). Препарат вносили по двум схемам: за 24 часа до инфицирования культуры клеток (схема 1) и непосредственно после инфицирования (схема 2). Далее планшеты инкубировали в термостате с СО2 при 37 °С. Цитопатогенное действие вируса изучали путем световой микроскопии на инвертированном микроскопе Nicon (Япония) через 48–72 часа после заражения. Для подсчета инфекционного титра вируса использовали формулу Рида и Менча [1]. Противовирусный эффект оценивали по снижению инфекционного титра вируса в присутствии препарата, сравнивая с контролем.

За минимально активную концентрацию (МАК) принимали концентрацию препарата, в присутствии которой инфекционный титр вируса снижается не менее чем на 1,25 Ig ТЦИД 50/0,2 мл по сравнению с контролем [6].

Результаты и обсуждение

Токсический эффект препарата Гроприносин для культуры клеток МDСК изучали в диапазоне концентраций от 800 до 50 мкг/мл после 72 ч инкубации. При визуальной оценке внешнего состояния клеточного монослоя обнаружен цитотоксический эффект в присутствии препарата только в концентрациях 800 и 400 мкг/мл. Концентрация препарата 200 мкг/мл вызывала незначительное изменение морфологии клеточного монослоя. В диапазоне концентраций 100–50 мкг/мл цитотоксический эффект отсутствовал. Таким образом, МПК препарата составила 100 мкг/мл.

Основной характеристикой противовирусного действия препарата является степень подавления репродукции вируса [6]. Противовирусную активность Гроприносина оценивали по способности препарата предотвращать развитие вирус­индуцированного цитопатического действия (ЦПД) в культуре клеток МDCK в диапазоне нецитотоксических концентраций препарата.

Исследования показали, что Гроприносин обладает противовирусным действием в отношении вирусов гриппа А и В. Ингибирующее влияние препарата на репродукцию вирусов гриппа выявлено как при предварительной обработке культуры клеток препаратом, так и при внесении препарата непосредственно после инфицирования монослоя (табл. 1). Однако противовирусное действие препарата было более выраженным при внесении по схеме 1.

В ходе проведения исследования был выявлен дозозависимый эффект: увеличение концентрации препарата сопровождалось увеличением противовирусного действия. Отмечено снижение инфекционного титра вируса на 3–4 Ig ТЦИД 50/0,2 мл в присутствии максимальной из исследованных концентраций.

Изучение противовирусной активности препарата в отношении вирусов гриппа не выявило типовой специфичности. Препарат ингибировал репродукцию как вирусов гриппа А (Н1N1 и Н3N2), так и вируса гриппа В. Однако ингибирующее влияние на репродукцию вирусов гриппа А было выражено сильнее, чем на репродукцию вируса гриппа В (табл. 2).

Основной характеристикой противовирусного препарата является широта интервала между пороговыми токсической и минимально эффективной концентрациями [6]. Для его определения используется химиотерапевтический индекс (ХТИ), представляющий собой отношение между МПК и МАК.

Гроприносин проявил высокую и умеренную противовирусную активность в отношении штаммов вирусов гриппа

А/Минск/108/09 (Н3N2), A/Минск/124/08 (H1N1) и штамма пандемического вируса гриппа А/Минск/94/09 (H1N1)-р (ХТИ составлял 4–16). Противовирусная активность препарата в отношении штамма вируса гриппа В/Минск/119/09 характеризовалась как умеренная (при предварительной обработке культуры клеток МDСК ХТИ составил 4) и слабая (при внесении препарата сразу после инфицирования монослоя ХТИ составил 2).

Таким образом, как показали проведенные исследования, Гроприносин обладает выраженным противогриппозным действием в отношении вирусов гриппа типа А и умеренным действием в отношении вирусов гриппа типа В. Эффективность препарата при предварительном внесении за 24 часа до инфицирования монослоя выше, чем при внесении препарата сразу после инфицирования.

Выводы

1. Грипп поражает преимущественно детей раннего возраста (до 3 лет).

2. Вирус гриппа А циркулирует на протяжении всего года с пиком в период эпидемического подъема респираторной заболеваемости, а вирус гриппа В — в виде спорадических случаев.

3. Клинически грипп протекает с наличием типичных признаков — интоксикации и респираторного синдрома, с редким развитием осложнений.

4. Наличие воспалительных изменений (лейкоцитоз, палочкоядерный сдвиг формулы влево) и отсутствие специфических изменений (лимфоцитов, лейкопения) в гемограмме в ранние сроки болезни не является основным диагностическим критерием для назначения антибактериальной терапии.

5. Установлено, что инозина пранобекс (Гроприносин) обладает выраженным противогриппозным действием, снижая репродукцию вирусов гриппа на 3–4 Ig ТЦИД 50/0,2 мл при обработке инфицированного монослоя по профилактической схеме. Минимальные концентрации Гроприносина, оказывающие противогриппозное действие в отношении вирусов гриппа А, составили 6–25 мкг/мл, в отношении вируса гриппа В — 25–50 мкг/мл.